客户文章 | 徐州医科大学李安安团队发现帕金森病中嗅觉缺陷的神经机制

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帕金森病（PD）是一种神经退行性疾病，其特征是运动障碍，包括运动迟缓、僵硬、静止性震颤和姿势不稳。值得注意的是，在帕金森病患者中也经常观察到许多非运动症状，其中一些非运动症状的出现比运动症状的发生更早几年。例如，嗅觉障碍是帕金森病最常见的非运动症状，至少90%的病例出现嗅觉障碍，通常在运动障碍发生前至少5-10年。尽管嗅觉功能障碍与帕金森病密切相关，并被认为是帕金森病的一个可能的生物标志物，但这种功能障碍背后的神经机制仍大部分未知。

帕金森病的一个显著的病理特征是神经元内异常α-突触核蛋白的聚集。早期研究发现异常的α-突触核蛋白聚集在中枢神经系统中遵循特定的分布模式，重要的嗅觉中心如嗅球（OB）和前嗅核是第一个被发现的α-突触核蛋白聚集的部位。由于异常的α-突触核蛋白在OB中的聚集早于在黑质中的聚集，这至少可以部分解释为什么在PD的运动症状出现之前发生嗅觉功能障碍。因此，确定异常的α-突触核蛋白聚集如何影响OB和嗅觉功能可能为PD的病理过程提供关键信息。

北京时间2021年12月13日，徐州医科大学李安安研究组在npj Parkinson's Disease 在线发表题为“α-Synuclein aggregation in the olfactory bulb induces olfactory deficits by perturbing granule cells and granular–mitral synaptic transmission”的研究论文，揭示了嗅球内α-突触核蛋白聚集导致嗅觉缺陷的神经基础。

在这项工作中，作者研究了OB中α-突触核蛋白聚集如何在细胞和突触水平上影响嗅觉行为和神经元活动。为了研究α-突触核蛋白如何直接影响OB神经元的活动并研究潜在的神经机制，作者通过靶向注射腺相关病毒（AAV）载体，过度表达双突变体人α-突触核蛋白（A53T和A30P），诱导α-突触核蛋白在OB中聚集。在观察到α-突触核蛋白聚集体损害了嗅相关行为并改变了体内单个细胞和群体水平上OB神经元的正常神经活动后，进一步证明，颗粒细胞（GCs）活性降低和抑制性突触传递受损可能是OB中α-突触核蛋白聚集引起的神经活性变化的原因。

首先，作者将AAV9-CMV-hm-Syn-ires-GFP注射到C57BL/6J小鼠的双侧OB中，以过度表达人突变α-突触核蛋白和绿色荧光蛋白，对照组小鼠接受双侧OB注射AAV9-CMV-GFP，仅表达GFP。如图1c所示，在GFP对照组和hα-syn组的OB切片中均观察到GFP阳性细胞。使用抗α-突触核蛋白抗体进行的western blot分析表明，注射AAV-hα-突触核蛋白的小鼠OB组织中外源性人总α-突触核蛋白的表达显著高于对照组小鼠的组织，且其中α-突触核蛋白聚集主要存在于OB，很少扩散到更高的嗅觉中心。

图1  外源性高表达的人α-突触核蛋白在OB中聚集 

尽管在遗传和药物诱导的PD小鼠模型中进行的一系列研究显示嗅觉相关行为的损害，但目前尚不清楚选择性诱导OB中的α-突触核蛋白聚集是否会影响嗅觉感知。为此，作者直接验证了OB 中α-突触核蛋白聚集对嗅觉功能的影响。作者通过掩埋食物颗粒实验测试嗅觉的敏感性，与对照组相比，过度表达人突变体α-突触核蛋白的小鼠找到被褥下食物颗粒的时间明显更长。然而，对照组和hα-syn组在被褥表面定位食物颗粒的时间上无明显差异。实验结果表明，hα-syn组小鼠的嗅觉能力受到影响，但他们获取食物的动机是正常的。作者进一步研究了hα-syn组小鼠是否在感知气味的能力上存在缺陷，即气味是令人愉快的还是令人厌恶的。在嗅觉偏好/回避实验中，实验结果表明，OB中人类突变体α-突触核蛋白的过度表达会导致对有吸引力气味的先天反应的缺陷。

图2  OB中过度表达α-突触核蛋白损害小鼠嗅觉功能

为了更进一步地研究OB中α-突触核蛋白聚集损害正常嗅觉功能的潜在神经基础，作者使用电生理技术记录了清醒小鼠的二尖瓣/簇状细胞（M/Ts）的峰值（OB的主要输出神经元，在气味信息的神经表征中起着至关重要的作用）。电生理信号观察到M/T强烈地自发放电，与对照组相比，hα-syn组的M/Ts自发放电显著增加。因此，证实了OB中α-突触核蛋白的聚集增强了M/Ts的持续的基线活性。

图3 OB在体内记录的M/T自发和气味诱发放电

由于OB中的α-突触核蛋白聚集导致体内单个M/T的过度活跃，作者接下来研究了聚集的α-突触核蛋白如何导致神经活动的这些变化。在对照组切片和hα-syn小鼠组切片中，二尖瓣细胞均显示出强烈的自发放电，但是hα-syn小鼠组OB切片的二尖瓣细胞自发放电率显著高于对照切片。在体外实验中，hα-syn切片的二尖瓣细胞放电率也是明显高于对照切片。为了进一步了解OB中的α-突触核蛋白聚集是否影响二尖瓣细胞的兴奋性，作者在电流钳模式下记录了二尖瓣细胞的电流诱发动作电位（AP）。与对照切片相比，来自hα-syn切片的细胞显示出显著更高的放电率，更低的阈值和更短的起始潜伏期，但膜电位保持不变。这些结果进一步证实了α-突触核蛋白聚集增加二尖瓣细胞的兴奋性。同时，为了验证抑制性电输入是否参与α-突触核蛋白的作用，作者发现α-突触核蛋白聚集显著降低了二尖瓣细胞中的微型抑制性突触后电流（MIPSC）的频率，但不是MIPSC的振幅，这些结果表明，OB中的α-突触核蛋白聚集减弱了对二尖瓣细胞的抑制电输入。

图4 α-突触核蛋白聚集体增加体外二尖瓣细胞自发和诱发放电

尽管有几类GABA能中间神经元直接向OB中的二尖瓣细胞发送抑制性输入，但GCs是主要的一类通过树突突触显著调节二尖瓣细胞的活性的GABA能中间神经元。因此，作者接下来开始验证α-突触核蛋白聚集是否影响从GCs到二尖瓣细胞的抑制性传递。作者通过光遗传学技术，证实hα-syn组的成对脉冲抑制（PPD）显著低于对照组，但两组之间第一个光诱发抑制性突触后电流（eIPSC）的振幅没有差异。实验结果表明，α-突触核蛋白聚集对OB中GABA能神经元的抑制位点可能在GCs的突触前膜。为了进一步证实α-突触核蛋白聚集是否影响GCs中的神经活动，作者验证了α-突触核蛋白的过度表达是否改变了GCs的兴奋性。作者发现在不同的电流幅度刺激下，与对照组相比，hα-syn组细胞的诱发峰放电率显著降低和起始潜伏期明显延长，以及膜电位的轻微降低。以上的实验结果表明α-突触核蛋白聚集降低了GCs的兴奋性。

图5 α-突触核蛋白聚集体减少二尖瓣细胞记录的eIPSC的PDD

最后，为了证实α-突触核蛋白聚集影响GCs的神经功能，作者通过纤维光度测定系统记录了头部固定清醒小鼠在气味呈现期间GCs中的实时钙动力学。在对照组和hα-syn小鼠中，气味出现均可引起GCs中群体钙信号的强烈增加。气味在对照组中能引起大多数小鼠的强烈反应，但在hα-syn组中它们只引起微弱反应；与对照组相比，hα-syn组GCs中的气味诱发钙反应显著降低。这些结果表明OB中的α-突触核蛋白聚集降低了GCs中气味诱发的神经活动。因此，GCs似乎与上面观察到的M/T过度活跃密切相关。

图6 α-突触核蛋白聚集体对颗粒细胞气味诱发钙反应的影响

在这项研究中，作者研究了OB中α-突触核蛋白聚集如何在细胞和突触水平上影响嗅觉行为和神经元活动。由于OB是大脑中第一个嗅觉中心，也是α-突触核蛋白聚集的最早部位之一，因此α-突触核蛋白聚集后的嗅觉功能障碍通常被解释为OB的损伤。该研究结果为发现OB中α-突触核蛋白聚集对OB神经元正常功能的有害影响提供了直接证据，并确定了其神经机制。然而，α-突触核蛋白影响OB中GCs的潜在分子机制可能非常复杂，需要进一步研究。总之，本研究确定了OB中的α-突触核蛋白聚集是如何损害OB输出神经元的自发活动和气味诱发反应，最终导致了嗅觉功能障碍，这些研究发现对于理解α-突触核蛋白对全脑毒性作用的神经机制以及帕金森病的神经病理学具有重要意义。

该研究是由徐州医科大学李安安教授课题组完成，李安安教授主要从事感觉神经生物学尤其是嗅觉方向的研究，在细胞外电生理记录、动物嗅觉行为学以及光遗传技术方面积累有丰富的理论和实践经验；同时对神经影像学有一定的基础，从事过内源性光学成像和fMRI 对嗅球功能活动的研究。

产品介绍

在本研究中，研究者使用的473nm智能光遗传刺激器由纽顿科技研发制造。该系列产品可以实现多种实验动物自由活动情况下的精确刺激，对不同脑区间的神经活动进行研究。作为国内第一家智能光遗传设备设计者，纽顿科技以稳定可靠的各类耗材在调控多种行为研究的神经环路中发挥重要作用。

有线智能光遗传系统--双光源

企业简介

作为全球顶尖的生命科学产品及解决方案的研发和生产商，佳量医疗旗下神经科学品牌 -纽顿科技 (NEWDOON INC)从实验室走出，又回到实验室，产研结合，始终以领先的技术和创新能力为核心，开发实验室尖端仪器。从最早期的有线光遗传学系统起步，逐步研发出了无线光遗传系统，光纤记录系统，不仅填补了国内外多项技术空白，也成为全球同行业中领军的企业。纽顿科技以脑科学研究为核心发展方向，通过与高校合作，带给科研人员全新的实验体验，实验效率大大提高。