魏文胜课题组报道升级版RNA编辑技术：LEAPER 2.0

细胞与基因治疗领域 2022-06-21

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Nature Biotechnology｜魏文胜课题组报道升级版RNA编辑技术：LEAPER2.0

RNA编辑是近年来兴起的基因编辑技术。2019年，北京大学、北大-清华生命科学联合中心魏文胜课题组在Nature Biotechnology杂志报导了新型RNA编辑技术LEAPER¹。与以CRISPR为基础的DNA或者RNA编辑技术不同，LEAPER仅需要在细胞中表达特殊设计的RNA（ADAR-recruiting RNA, arRNA）即可招募细胞中内源脱氨酶ADAR，实现靶向目标RNA中腺苷A→肌苷I（鸟苷G）的编辑。由于无需引入外源编辑酶或效应蛋白，避免了由此引起的递送以及相关的免疫原性等问题。另外作为RNA精准编辑工具，LEAPER不会引起基因组序列改变，在安全性方面具有优势。尽管LEAPER在科研和疾病治疗中具有可观的潜力，该技术还存在一定的局限：一是LEAPER利用的是内源编辑酶，其编辑效率会因此受限；另外，具有一定长度的arRNA可能使目标编辑位点邻近的碱基发生脱靶编辑，因此该技术亟需优化升级。 2022年2月10日，北京大学、北大-清华生命科学联合中心魏文胜课题组在Nature Biotechnology杂志发表“Engineered circular ADAR-recruiting RNAsincrease the efficiency and fidelity of RNA editing in vitro and in vivo”的研究长文。该研究发现，通过优化表达载体中的启动子增强arRNA表达可以显著提升LEAPER系统的编辑效率，表明arRNA在细胞中的丰度对于编辑效率十分重要。然而线性arRNA在细胞内容易被降解的特点成为了制约因素。为了克服这一问题，课题组通过设计并运用可招募ADAR的环形RNA（circular ARAR-recruiting RNA, circ-arRNA），实现了编辑效率提升。

环形RNA没有5’或3’末端，可以避免核酸外切酶的切割，在细胞内相比于线性RNA具有更好的稳定性和更长的半衰期。研究发现，circ-arRNA能够维持较长时间的高水平表达。在多个内源转录本位点中，circ-arRNA平均编辑效率相比于线性版本提升了超过3倍，同时也可维持长达近半个月的有效编辑。通过腺相关病毒（AAV）递送，遗传编码的circ-arRNA可以在人的原代细胞和类器官中实现长时程的RNA编辑。另外，体外合成的circ-arRNA也可实现高效的靶向编辑，并且与遗传编码的circ-arRNA具有类似的特征。

图一、Circ-arRNA在内源转录本上实现高效、精准的编辑

由于ADAR蛋白的底物为双链RNA，靶向RNA与circ-arRNA形成的双链区域内的腺苷酸会有不同概率的脱氨风险。消除这种邻近碱基的脱靶编辑（bystander off-target editing）是实现更加精准的单碱基编辑的关键。进一步研究发现，当删除arRNA或circ-arRNA上非靶向腺苷酸对面的核苷酸后，可以有效避免非靶向腺苷酸的编辑。据此重新设计的circ-arRNA在内源转录本上基本消除了双链RNA区域内目标转录本上的脱靶，同时维持了较高的精准靶向编辑效率。近期，Thorsten Stafforst课题组报道了名为CLUSTER的RNA编辑技术²，该技术虽然降低了邻近碱基的脱靶编辑效率，但是其靶向编辑效率仍处于和线性arRNA类似的水平。与此相比，circ-arRNA不仅提升了RNA编辑效率，还消除了邻近碱基的脱靶编辑，这一升级版技术被命名为LEAPER 2.0。

图二、LEAPER 2.0 — 通过工程化的circ-arRNA实现高效、精准的RNA编辑

接下来对LEAPER 2.0应用潜能的评估显示，circ-arRNA可以成功激活Wnt信号通路，修复TP53基因中的致病突变使其表达的p53恢复转录调节功能。使用AAV将circ-arRNA递送至Hurler综合征疾病模型小鼠体内，可以成功修复Idua致病突变并恢复IDUA的酶活。这些结果表明，LEAPER 2.0在科研和疾病治疗中具有令人期待的优势与潜能。

北京大学、北大-清华生命科学联合中心魏文胜课题组博士研究生伊宗裔（CLS）、博士后璩良和博士研究生唐慧贤（BIOPIC）为该论文的共同第一作者。该研究项目得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金重点项目、北京市科委生物医学前沿创新推进项目、北京未来基因诊断高精尖创新中心、北大-清华生命科学联合中心以及中国博士后科学基金的支持。

文章链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-021-01180-3

1. Qu, L. et al. Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs. Nat Biotechnol 37, 1059-1069 (2019).
2. Reautschnig, P. et al. CLUSTER guide RNAs enable precise and efficient RNA editing with endogenous ADAR enzymes in vivo. Nat Biotechnol (2022).

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