碱基编辑器最新研究进展一览

碱基编辑器通过将脱氨酶与 Cas9 切口酶（nCas9）融合, 可在不发生双链DNA断裂和无需DNA模板的条件下实现碱基的定点突变。碱基编辑器拓宽了研究人员对基因突变功能研究；另外由于点突变代表了人类致病性遗传变异的最大类别，因此碱基编辑器通过纠正点突变在遗传疾病治疗中具有广泛应用前景。此外，碱基编辑可以对分裂细胞和非分裂细胞进行修改，这与仅限于应用于分裂细胞的同源重组修饰（HDR）相比有明显优势。碱基编辑在纠正基因突变导致的小鼠功能丧失方面已显示潜在的治疗效果，其中一个显著的例子是最近使用碱基编辑纠正小鼠的HutchinsonGilford早衰综合征[1]。使用碱基编辑治疗家族性高胆固醇血症的早期临床试验已经开始，其他使用碱基编辑治疗镰状细胞病的临床试验将于今年开始。碱基编辑技术消除了DSB的引入，是实现精确基因编辑的重要一步。然而，目前碱基编辑器仍然在编辑效率、特异性和递送手段等方面面临挑战。本文将对该领域近一两年的研究进展进行梳理，简述目前针对这三个挑战的相关解决手段。

1. 拓展碱基编辑器编辑范围

目前广泛使用的腺嘌呤碱基编辑器（ABE）和胞嘧啶碱基编辑器(CBE)可以分别实现A-to-G和C-to-T碱基之间的转换（transition；即嘌呤变嘌呤，嘧啶变嘧啶）。在CBE基础上开发出的鸟嘌呤编辑器（GBE），可实现C-to-G碱基之间的颠换（transversion；即嘧啶变嘌呤）。GBE是由与胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶 DNA 糖基化酶 (UNG) 融合的 Cas9 切口酶 (nCas9-D10A) 组成。在 RNA 的引导下，胞嘧啶脱氨酶将靶标 C 转化为 U。UNG 从 DNA 中消除 U 并产生无嘌呤/无嘧啶 (AP) 位点。AP 位点的创建，再加上 nCas9 在DNA非编辑链上的切口，启动 DNA 修复和复制，导致 G 在 AP 位点的有利插入。这些事件导致了 C 到 G 的编辑结果。然而，目前尚不清楚 G 的引入如何优于其他两个碱基(T 和A) [2]。根据GBE的工作原理推测，如能够将A脱氨形成的I（次黄嘌呤）碱基去掉，以产生AP位点，便可实现A到T 或A到C的碱基颠换。2023年1月9日，杨辉团队等发现N-甲基嘌呤DNA糖基化酶（MPG）具有切割I 的活性，通过将MPG和ABE8e融合,并经过多次工程化改造形成AYBE碱基编辑器，其实现A到T 或A到C的碱基颠换效率最高达72%。此外，该团队通过引入Polη蛋白（跨损伤DNA 合成(TLS)聚合酶），可导致AP中间体互补位置倾向于A碱基插入，通过该方法明显提高了AYBE对A到T碱基的编辑效率，最高达66%（图一） [3]。由于在人类单点突变导致的遗传疾病中，约四分之一的致病突变需通过腺嘌呤碱基的颠换来进行修复，因此AYBE的开发具有重要的应用潜力。

图一、AYBE工作原理[3]

ABE可实现A 到 G（或 T 到 C）的转换，原则上可解决47%的基因致病突变导致的人类疾病。然而在哺乳动物中并无作用于单链DNA的腺嘌呤脱氨酶，为克服这一障碍，刘如谦实验室通过定向进化的方法对大肠杆菌的 tRNA 腺苷脱氨酶 (TadA)进行筛选获得了一个编辑效率较高的突变体-TadA*；进化的 TadA 结构域与 Cas9 蛋白融合以创建腺嘌呤碱基编辑器[4]。现有ABE及其衍生工具的腺嘌呤脱氨基酶均是以大肠杆菌TadA为模板进行多轮进化改造而来。2023年1月程田林课题组通过对50余种TadA同源蛋白进行筛选发现其中25种TadA同源蛋白可通过单/双点突变而具有碱基编辑活性，其中9种主要表现为ABE活性，9种同时具ABE和CBE的活性，7种主要表现为CBE活性。随后该研究团队发现融合其中某些TadA同源物的碱基编辑器，具有极低的Cas9非依赖的DNA和RNA脱靶效应。最后，研究团队对TadA底物分析发现胞嘧啶脱氨酶可能是从腺嘌呤脱氨基酶TadA演化而来（图二）。这为ABE向CBE的活性改造提供了基础[5]。基于类似发现，李大力和David Liu课题组对TadA最新变种TadA-8e进行改造开发了依赖于TadA的新型CBE编辑器，该CBE编辑器在具有较小分子量的同时，可明显提高C到G的编辑特异性，但仍保留与BE4max相似的编辑效率[6, 7]。Nicole M. Gaudelli等应用相似方法利用其自主研发发的ABE8.20-m（ABE8s）[8]，也同样开发了基于TadA的CBE编辑器；基于该TadA的新型编辑器经过改造可具备较高的C-T和A-G同时编辑能力，较低的脱靶性，极大拓展了TadA的编辑范围[9]。

图二、脱氨酶进化过程[5]

通过将胞嘧啶脱氨酶、腺嘌呤脱氨酶和Cas9切口酶相融合，研究人员开发出了腺嘌呤和胞嘧啶双碱基编辑器（ACBE），这一双碱基编辑器可以在同一靶标位点实现C-T和A-G转化；研究表明 ACBE的C-T编辑效率与CBE相当，对A-G编辑效率则略有降低；但总体来说该双碱基编辑器效率高于CBE+ABE（详见往期文章：碱基编辑器及其临床相关研究进展）。针对ACBE中A-G编辑效率低的问题，2023年3月张晓辉等将ACBE原有的TadA和TadA* 替换为单链DNA结合蛋白Rad51DBD和TadA-8e，开发出高活性hyACBE, 与原有ACBE相比，该编辑器将A-to-G的编辑效率平均提升1.2-17.7倍，C-to-T和A-to-G同时编辑效率提升1.9倍，其C-to-T编辑效率也略有提升[10]。

另外将新型编辑器与PAMless Cas9 如 SpRY-nCas9，融合也能拓展其编辑范围。有研究人员将SpRY-nCas9将最新TadA-8e融合，并将TadA-8e domain和SpRY相关位点突变，可获得PAMless ABE，兼具高效性和特异性[11, 12]。

2. 提高碱基编辑器的特异性

尽管碱基编辑器经过多轮改造，已显著提供了其编辑活性，但其编辑窗口也随之增加。例如原始的低活性 NG-ABEmax 的编辑窗口仅跨越四个核苷酸（A4-A7，NG-Cas9 的PAM 在第 21-22 位），而NG-ABE8e除可在A4-A7窗口进行编辑外，还可以高效地编辑位点 22 -A11（效率>60%）和位点 23 -A12（效率>90%）。因此NG-ABE8e具有明显的旁观者效应[13]。未解决上述问题，谷峰等通过对NG-ABE8e引入R111T/N127K/Q154R 三突变，在维持与NG-ABE8e相似编辑效率的条件下，可使旁观者效应平均降低4倍（图三）[14]。

图三

尽管许多Cas9变体表现出改善的特异性，但这种改善是建立在牺牲其对靶DNA切割活性的基础上的。最近，一种新的Cas9变体Superfi -Cas9被设计出来，Nature报道它可以实现野生型的靶上切割率，但对错配有更高的辨别能力；在体外实验中，Superfi -Cas9可将错配切割率降低数千倍[15]。然而，Superfi -Cas9是否在细胞体内仍具有类似精准活性，以及其是否能够用以开发碱基编辑器并不清楚。与Nature文章结果不同，Ervin Welker等发现尽管Superfi -Cas9具有较高的保真性，但其体内外的切割活性较WT Cas9明显降低；Superfi -Cas9用以开发碱基编辑器时，作者发现Superfi -CBE3和-ABE7.10碱基编辑器以及Superfi -prime editor没有明显活性。当与ABE8e结合时，SuperFi-Cas9与HeFSpCas9类似，可执行高活性和高特异性的DNA碱基编辑，减少旁观者和SpCas9依赖的脱靶效应[16]。

David Liu和Nicole M. Gaudelli等课题组通过分子进化获得了高活性的ABE8 (ABE8e和ABE8s)，但其高活性可带来额外的旁观者及RNA脱靶编辑效应；另外ABE会对含有TCN motif的序列产生胞嘧啶编辑活性。上述ABE编辑器缺陷制约了其临床应用前景。2022年李大力等基于ABE8e的冷冻电镜结构，对ABE8e蛋白序列改造发现其N108Q突变可明显减少ABE8e腺嘌呤和胞嘧啶的旁观者效应；当进一步引入L145T突变(ABE9)，可将编辑窗口细化到1-2个核苷酸（sgRNA A5~A6），并消除了原有ABE8e对胞嘧啶的脱靶编辑（图四）[17]。

图四、ABE9编辑器[17]

3. 碱基编辑器递送

Cas9 衍生的碱基编辑器通常太大而无法被腺相关病毒 (AAV)携带，从而限制了潜在的治疗应用。最近多个超紧凑型 CRISPR 或CRISPR祖先系统已被确定，为单一AAV 递送碱基编辑器提供了可能。Cas12f 核酸酶作为最紧凑的 CRISPR核酸酶，其大小仅为传统 Cas9 和Cas12a 核酸酶的一半（详见往期文章：基因编辑进入迷你时代）。2023年程田林/赵兴明/仇子龙团队通过对胞嘧啶脱氨酶、腺苷脱氨酶进行饱和突变，以及与Un1Cas12f1的组合筛选发现了一系列新型迷你碱基编辑器miniABEs和miniCBEs，可实现单一AAV系统的递送和精准编辑；然而该种miniABEs高活性编辑限制在 A3-A4 和 A16-A17 位点，而miniCBEs仅在C3有较高的编辑效率[18]。因此，未来的工作需要开发具有扩展 PAM 序列的工程化 Un1Cas12f1 变体，或验证具有不同 PAM 序列的超紧凑型 CRISPR 系统的碱基编辑活性。另外，基于Un1Cas12f1的 miniBE 的编辑范围仍然有限，需进一步工程化改造。IscB 作为Cas9 蛋白祖先，大小仅为SpCas9的五分之二，因此它们可能与胞嘧啶脱氨酶（APOBEC）、腺苷脱氨酶（TadA）形成融合蛋白，以一种较小的蛋白复合物形式发挥碱基编辑功能（详见往期文章：基因编辑进入迷你时代）。基于IscB碱基编辑系统，其大小有望限制在AAV包装的上限（约为4.7kb）内，因此具有极大的临床应用价值。

参考资料：