AAV在悬浮HEK293细胞中的培养表达与优化
病毒载体越来越多地应用于基因治疗领域，重组腺相关病毒 (rAAV) 是基因传递系统中最常用的载体之一。对于rAAV病毒目前更多以HEK293细胞培养表达为主，并且HEK293细胞由贴壁培养转向悬浮培养已成为一个趋势。
本文分享一则使用WAVE 25培养悬浮HEK293细胞生产rAAV病毒的应用案例，主要开发了一种培养悬浮HEK293细胞表达AAV病毒多种血清型的工艺，并应用于WAVE 25生物反应器中表现出较好的病毒收获率。具体包括细胞培养、转染、收获的生产过程（图1）。
图1：从摇瓶到WAVE 25生物反应器的rAAV5生产过程
一
细胞培养
HEK293T (CRL-3216 ATCC) 细胞悬浮培养在HyClone的HyCell转染培养基中，培养基中添加4 mM L-谷氨酰胺和0.1% Pluronic F-68。细胞在摇瓶 (1-3 L) 中开始培养，以0.4×106个细胞/mL的细胞密度接种到WAVE 25中。WAVE 25波浪式生物反应器拥有3种规格托盘，适配不同体积的反应袋规格，可轻松实现10倍体积放大培养，还拥有精准稳定的温控、高效混合的性能以及操作灵活性，同一托盘可进行单培养或双培养。接种前，用空气充气细胞培养袋，并添加5 L无菌培养基到WAVE 25中，在37 ºC和5 % CO2下平衡过夜。平衡期间的搅拌转速设置为15 rpm。细胞在WAVE 25中扩增培养48 h，转速增加到20 rpm，角度为6°。转染时稀释至1×106个细胞/mL（±0.2×106个细胞/mL），体积至20 L。
传统的线速度运动模式，当摇摆到最大或最小设定角度时，瞬间抖动产生的较大剪切力会影响HEK293细胞生长。而WAVE 25独创钟摆式运动模式，当摇摆到最大或最小设定角度时，会紧急刹车，柔和地控制，在不影响混合效果的前提下，减少抖动，降低剪切力对HEK293细胞的损伤（图2）。
图2：WAVE 25的运动模式
二
转 染
使用三质粒转染系统（Rep/cap：helper：转基因GFP）和转染试剂聚乙烯亚胺 (PEI)（图3），将通过瞬时转染至HEK293T细胞以生产病毒载体。
转染参数：
细胞密度：1×106个细胞/mL
DNA (µg/mL) ：0.75
PEI/DNA比值 (µL/µg) ：2
转染体积 (占总量的百分比) ：5
孵育时间：15 min
温度：室温 (RT)
DNA比值 (rep/cap:helper:转基因GFP) ：1:1:2
图3：通过三质粒转染系统瞬时转染HEK293T细胞产生rAAV病毒
三
收 获
转染HEK293T细胞72小时后，使用0.5% Tween裂解细胞进行收获。收获的料液在分析前进行DNA酶处理。用qPCR评估病毒基因组 (VG) /L，用ELISA定量病毒颗粒 (VP) /L分析粗收获材料。通过VG/L和VP/L之间的比值来计算完整衣壳的百分比。研究的目标是在还未纯化的收获料液中达到1013 VG/L和1014 VP/L，完整衣壳的百分比至少10%。
四
结 果
为了验证该工艺的重复性，在WAVE 25生物反应器中以10至20 L的规模进行了三个生产批次。以生产rAAV5病毒为例（图4）。实验数据分析表明，在三次的批次生产中，获得了相似的病毒滴度，都达到了大约1013 VG/L和1014 VP/L，完整衣壳的百分比都大于10%（图5）。
图4：（左）WAVE 25生物反应器中rAAV5的三次生产过程。接种细胞后48小时，稀释细胞并转染，转染后72小时进行收获。（右）通过显微镜和荧光显微镜观察转染效果。
图5：WAVE 25生物反应器中三次rAAV5生产的病毒颗粒、病毒基因组全衣壳百分比。
AAV其他血清型的生产
使用以上相同工艺生产rAAV血清型2、8和9，在摇瓶、XDR-10和WAVE 25不同规格和生物反应器中进行了生产，都获得了与rAAV5相似的病毒滴度。这也证实了这种工艺表明适用于其他AAV血清型，并具有可转移性（图6）。
图6：在不同规模和生物反应器系统中生产rAAV血清型2、5、8和9的VP/mL。
五
讨 论
文章案例开发了一种强大的生产rAAV病毒多种血清型的工艺，在WAVE 25生物反应器中经过三次的批次生产，都表现出一致的良好结果。并且将该工艺应用转移到XDR10中也取得了成功。因此，对于较小规模的病毒生产，可以使用WAVE 25生物反应器，体积最高可达25 L。对于更大规模的培养，可以使用Xcellerex XDR系列生物反应器，同等工艺可放大高达2000 L。
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