AAV线性放大生产工艺详解
rAAV载体已被临床前和临床研究评估可以做为基因治疗递送系统，用于治疗囊性纤维化和血友病B等遗传疾病。目前已开发出多代rAAV，安全性和产量更高，并可以产生更有效的治疗效果。AAV5是临床研究中常见的血清型，它为rAAV其他血清型的工艺开发提供了合适的模型。
人胚胎肾 (HEK 293.2) 悬浮 (sus) 细胞系作为包装细胞系，通过三质粒转染至细胞生产rAAV5。细胞达到最佳性能取决于多种因素，例如特定细胞克隆的生长和生产力、培养基的组成、搅拌、溶氧和温度等培养条件。在设计细胞培养基时，了解这些因素如何影响细胞代谢过程是至关重要的。了解细胞系的代谢活性、营养需求和排泄物产生有助于确保使用正确的营养物质组合和数量，以最大限度地减少可能导致细胞毒性的排泄物产生。
我们使用HyClone peak expression培养基在摇瓶中培养HEK 293.2 sus细胞，并对细胞的生长、活力和rAAV产率进行了评估。之后使用Xcellerex XDR-10和XDR-200生物反应器对工艺的可放大性进行了研究，并与摇瓶培养工艺的性能进行比较。
一
材料与方法
01
细胞驯化
HEK 293.2 sus细胞 (ATCC) 从BalanCD HEK293培养基 (Fujifilm Irvine Scientific) 转移到HyClone Peak expression培养基中进行细胞驯化，种子细胞密度为5.0×105 细胞/mL。室温下，每3-4天往细胞中加入新鲜培养基进行细胞传代，直到细胞达到24-30小时之间的群体分裂期 (PDT) ，细胞活力超过90%。
02
摇瓶培养
将HEK 293.2 sus细胞接种于装有30-50 mL HyClone peak expression培养基的125 mL摇瓶中，接种密度为0.4×106 个细胞/mL。在摇床中以140 rpm、37 °C和5% CO2的条件进行培养。当细胞计数和活率下降到一定程度时终止培养。细胞培养平行三次重复进行。
03
病毒扩增
通过三质粒转染系统对细胞进行转染。该系统由一个递送腺病毒基因的pHelper质粒、一个Rep/Cap（复制和衣壳蛋白）质粒和另一个在末端反向重复序列 (ITR) 之间包含有目的基因（GOI，在本研究中是指绿色荧光蛋白 [GFP]）的质粒组成，这三个质粒对于将目的基因包装到AAV衣壳中必不可少。helper:Rep/Cap:GOI质粒的比例为 2.0:1.5:1.0。在密度为2×106 个细胞/mL的培养体系中，以 2:1 (PEI:DNA) 的比例使用线性化聚乙烯亚胺 (PEI, Polysciences Inc.) 诱导转染。收获时间 (TOH) 为转染后第4天，通过微滴式数字PCR (ddPCR) 检测绿色荧光蛋白 (GFP) 转基因盒，从而确定病毒滴度。
04
病毒滴度
在摇床中，用100 μL 10×裂解缓冲液（5% 吐温 20，10 mM氯化镁，200 mM Tris，pH 8.0）和20 U/mL的Turbonuclease酶处理约900 μL培养物4小时。将等分试样以15,000×g离心10 min，并对粗裂解上清液进行ddPCR分析。
05
生物反应器培养
以0.5×106 个细胞/mL的密度将HEK 293.2 sus细胞接种于装有HyClone peak expression培养基的一次性Xcellerex XDR-10 L细胞培养袋中，生物反应器的最终培养体积为9 L。使用表1中列出的培养参数，在XDR-10生物反应器中进行细胞培养。将细胞从摇瓶转移到 WAVE生物反应器（Xuri细胞扩增系统W25）中，再转移到XDR-200生物反应器中，进行细胞扩增。
表1：生物反应器中细胞培养工艺放大条件
参数 | XDR-10生物反应器 | XDR-200生物反应器 |
培养基 | HyClone peak expression培养基 | HyClone peak expression培养基 |
工作容量 | 9 L | 180 L |
叶轮转速 | 120 rpm（上扬方向） | 158 rpm（上扬方向） |
温度 | 37 °C | 37 °C |
pH设定值 | 7.3（通过CO2和碱进行控制） | 7.3（通过CO2和碱进行控制） |
溶氧 (DO) 设定值 | 40%（通过富氧空气进行控制） | 40%（通过富氧空气进行控制） |
O2流速 | 通过比例积分微分 (PID) 进行控制 | 通过PID进行控制 |
CO2流速 | 通过PID进行控制 | 通过PID进行控制 |
二
结果
01
采用HyClone peak expression培养基对细胞进行驯化
将保存于BalanCD HEK 293培养基 (Fujifilm Irvine Scientific) 中的HEK 293细胞在HyClone peak expression培养基中直接解冻。3-4天后，细胞分裂至密度为0.4至0.5×106 VC/mL，并维持几次传代培养。对VCD和PDT进行监测（图1）。
使用第5代传代细胞建立细胞库。将细胞冻存于加入二甲亚砜 (DMSO) 的HyClone peak expression培养基中，浓缩至细胞密度为20×106 VC/mL，并将1 mL等分试样转移至冻存管中。将细胞库冻存于CoolCell冻存盒 (Cool Lab, LLC) 中，在-80 °C下过夜，然后将其转移至液氮储罐中。
待多个细胞库冻存管解冻后，我们对细胞的VCD和PDT进行了监测，以确保细胞库的一致性（图2）。
图1：采用HyClone peak expression培养基直接对HEK 293细胞进行驯化
图2：将多个用第5代传代细胞建立的细胞库冻存管解冻后，对细胞进行VCD和PDT监测
02
摇瓶中的高密度培养
在本实验中，我们在摇瓶中用HyClone peak expression培养基培养了不同代次的细胞，培养时间长达13天（图3）。对VCD、细胞活力和PDT进行全程监测。我们可以从图3中看出，HyClone peak expression培养基支持的细胞生长密度范围在6.0-9.0×106 个细胞/mL之间。
图3：摇瓶中的高密度细胞培养 (A) ，解冻后的细胞培养 (B) ，第3代和第8代细胞培养 (C)
03
在摇瓶中进行瞬时转染优化
采用三重质粒转染法对已驯化的HEK293.2 sus细胞进行瞬时转染。在该过程中，PEI与DNA 形成复合物，然后被导入到宿主细胞中。使用绿色荧光蛋白 (rAAV5-GFP) 对摇瓶中的HEK293.2.sus细胞进行转染，质粒的使用量为每2×106 个细胞对应2 μg DNA。
为研究该培养基对PEI-DNA复合物稳定性的影响，测试了转染复合物在HyClone peak expression培养基中的占比（占rAAV生产总体积的5%或10%）（图4）。每种条件按三次重复在摇瓶中进行实验。结果显示占比为10%时，一致性较好，因此在使用HyClone peak expression培养基的HEK293.2细胞rAAV生产实验中，推荐使用该体积。
图4：使用HyClone peak expression培养基比较不同体积PEI和DNA复合物（5%和10%）在摇瓶中的转染收率差异。基因组拷贝数=GC
04
rAAV5在生物反应器中的放大生产
最后，我们将rAAV5-GFP的生产进行了放大，由摇瓶培养放大到XDR-10生物反应器培养，然后进一步放大培养到XDR-200生物反应器（图6）。结果显示，虽然与摇瓶培养的产率稍有下降，但总体来说该工艺可在10 L至200 L生物反应器之间进行放大。GFP的百分比峰值出现在转染后第48小时（2天，未显示相关数据）。
图6：使用 (A) XDR-10生物反应器在10 L培养规格中生产rAAV5-GFP以及使用 (B) XDR-200生物反应器在200 L培养规格中生产rAAV5-GFP。
总 结
重组腺相关病毒载体 (rAAV) ，例如rAAV5血清型，已被广泛用做基因治疗递送系统。XDR生物反应器是常用的培养设备，培养体积为10 L到2,000 L。此平台整合一次性耗材技术和搅拌生物反应器设计的优点，采用M40e斜叶搅拌桨设计，同时具备传统象叶桨低剪切力和斜叶搅拌桨高效混合的特点，深层通气底盘配置0.5 mm、1 mm的大泡通气设计，满足氧消耗的同时降低气泡破裂产生的剪切力，非常适合HEK 293细胞培养。本文研究了如何在Xcellerex XDR-10和XDR-200生物反应器中进行放大性生产，并与摇瓶培养工艺的性能进行比较。
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课程题目:《HEK293悬浮/贴壁ADCF可放大工艺优化及案例分享》
1. 对HEK 293构建ADCF生产平台目的及供应商管理
2. HEK 293细胞株改造方向及案例分享
3. HEK 293 ADCF生产材料的优化及案例分享
4. HEK 293批次培养及灌流工艺案例分享
参考文献：
[1] Mueller, C, Flotte, TR, Clinical gene therapy using recombinant adeno-associated virus vectors. Gene Ther. 2008;15(11):858-863. doi:10.1038/gt.2008.68
[2] Flotte, T, Gene therapy progress and prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Ther. 2004;11:805-810. https://doi.org/10.1038/sj.gt.3302233