2009年，荷兰Hubrecht研究所的 Hans Clevers 等人使用来自小鼠肠道的成体干细胞培育出首个肠道类器官，开创了类器官研究的时代。
类器官（Organoids）是简单的基于组织工程细胞的体外模型，它概括了体内组织的复杂结构和功能的许多方面。自2009年以来，类器官领域研究成果不断，许多新型类器官和更复杂的类器官不断涌现。其既可用于人体组织发育、再生和修复等基本机制研究，也可用于疾病诊断、疾病建模、药物发现和个性化医疗等临床诊疗领域。
鉴于类器官在基础研究和临床应用中的广阔前景，2021年1月，我国科技部发布“十四五”国家重点研发计划，将“类器官与人源化动物模型”列为重点研究方向，拟建立包括类器官在内的多种疾病模型，以发掘疾病诊疗新靶标和新策略。
然而，国内类器官领域尚缺乏全面的著作，很难满足我国类器官领域科研工作者、医生和企业的最新需求。因此，亟需对类器官涉及的理论基础、研究进展、前沿技术、行业进展以及面临的挑战等进行系统的梳理，形成相对完整的知识体系。
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近期，新加坡国立大学、爱荷华州立大学、中国科学院分细胞科学卓越创新中心、马克斯普朗克分子细胞生物学和遗传学研究所和加州大学洛杉矶分校的研究人员合作，在 Nature 旗下综述期刊 Nature Reviews Methods Primers 上发表了关于类器官的长文综述。
详细介绍了开发类器官的基本原理、生成类器官的关键考虑因素，还阐述了类器官在不同应用中的局限性，以及未来几年类器官工程的重点。
类器官是一种自组织的3D组织，通常来自干细胞（多能、胎儿或成人），用于模拟器官的关键功能、结构和生物学复杂性。组成类器官的细胞可以来自诱导多能干细胞（iPSC）或组织来源细胞（TDC），包括正常干/祖细胞、分化细胞和癌细胞。与传统的2D培养和动物模型相比，类器官培养在体外重现体内组织样结构和功能的同时，使模型具有患者特异性。
类器官培养比动物模型更容易操作和深入生物学研究。因此，类器官培养已被用于各种应用，包括药物发现、个性化诊断和细胞治疗等等。
类器官培养在细胞组成方面表现出显著的异质性和可变的复杂性，在自组装过程中可能出现形态发生控制不佳的情况，并且通常缺乏基质、血管和免疫组分。因此，非常有必要通过利用我们对器官发生以及细胞如何以干细胞生态位的形式与其细胞和物理微环境相互作用的理解，来改善类器官培养。基于这些见解，可以制定生物工程策略，在类器官发育过程中精确控制干细胞决策。
基于工程细胞的体外模型（例如类器官）是否需要忠实再现体内原发器官的结构和功能，目前尚有争议。一种趋势是在体外尽可能多地再现体内组织结构和功能，以证明日益复杂的模型的生理相关性。对于生物工程师来说，人工创建的体外模型只需要再现体内组织的特定特征，与感兴趣的生理或疾病功能相关即可。对于创建高度复杂的模型并期望它们准确地模拟体内原发器官，人们持乐观态度。对于大多数研究人员来说，较简单的模型对于机制研究和应用来说比更复杂的模型更可靠。在确定的物理化学条件下，小肠、结肠、胃、食道、舌头、肝脏、肺、胰腺、心脏、耳朵和皮肤等组织均可从诱导多能干细胞、成人或胎儿细胞以及干细胞/祖细胞或分化细胞中获得。任何给定类器官的起始细胞群都是至关重要的，不仅影响所获得结构的变异性和异质性，而且影响它们旨在模拟的组织的功能。为了建立组织来源的类器官或癌症类器官，分别通过优化的组织解离方法获得组织驻留干细胞/祖细胞/分化细胞或肿瘤细胞。对于诱导多能干细胞（iPSC）来源的类器官，iPSC细胞系被建立并作为起始细胞充分表征。患者/组织来源的干细胞通过优化的组织解离方法获得，然后嵌入到模拟干细胞微环境（Stem cell niche）的三维基质中。iPSC可以作为未分化的克隆群体在饲养层细胞上维持和扩增。为了举例说明组织来源的类器官的产生，论文作者使用肠道类器官作为例子，因为这是第一个组织来源的类器官。小肠和结肠被纵向打开，清洗，然后切成2-4毫米的碎片，以增加酶消化或进一步机械解离的表面积。EDTA处理用于螯合钙，破坏细胞-细胞粘附和组织完整性。从收集的隐窝部分中去除较大的组织碎片和完整的细胞，收获的原发性肠隐窝用于播种和产生肠道类器官培养物。类器官培养的起始细胞群通常来自成人或胎儿组织活检样本。最常用的组织解离方法是酶消化，用来溶解细胞外基质（ECM）。酶解过程的酶的组成和效率因组织类型而异，在某些情况下，可以添加DNA酶来去除坏死细胞释放的过多DNA。根据组织类型，组织碎片可以进一步与酶（如胶原酶、弹性蛋白酶或去磷酸酶）孵育，产生单细胞悬浮液，然后在基质胶中播种。酶解法可能会影响回收细胞的细胞状态，因为它可能需要在酶混合物中延长时间来解离大多数组织驻留干细胞。组织解离也可以用机械方法实现；虽然机械解离更快，更便宜，但细胞产量和活力可能不一致。机械法和酶解法可以结合产生更好的细胞产量。组织解离后，利用已知的生物标志物或物理特性来识别和收集用于类器官发育的组织来源细胞（TDC）。组织特异性干细胞标志物通常用于识别和分离所需的干细胞以产生类器官。荧光激活细胞分选或磁性激活细胞分选根据多个参数分离细胞，包括大小、形状和细胞表面标志物表达。 iPSC可以作为未分化的克隆群体在许多代中保持和扩增。未分化的人类iPSC通常在饲养层细胞或确定的ECM底物上保持。由于单个iPSC在体外存活不佳，iPSC通常作为细胞聚集体收获，这保持了细胞-细胞间接触，产生了具有更高活力的细胞群体。解离酶混合物的选择应基于细胞敏感性水平和培养细胞是否分泌过多的ECM。来自活检样本或手术切除的肿瘤组织通常也会像正常组织一样进行处理，分离肿瘤细胞以生长为类器官。从外周血、腹水和胸腔积液等液体样本中分离出的肿瘤细胞可用作生成类器官的起始材料。患者来源的肿瘤类器官可以从微创巴氏涂片获得的样本中产生。由于肿瘤细胞数量少，组织活检样本或液体样本中的肿瘤细胞可以首先在动物模型中扩增作为异种移植物，以便获得足够的细胞用于类器官的生成。在肿瘤组织的情况下，最好限制组织解离，以便分离细胞簇而不是单个细胞。影响肿瘤来源类器官产生的一个关键因素是，从组织中分离出来的细胞通常既含有癌细胞，也含有正常细胞。虽然对于某些肿瘤，可以通过先验分选来富集肿瘤形成细胞，但对于大多数肿瘤，目前还没有可靠的方法在将正常细胞群和肿瘤细胞群播种到基质中进行培养之前分离。克服这一问题的一种方法是利用培养条件，通过使用选择性培养基来忽略正常类器官生长所需的某些因素，因为肿瘤细胞在恶性转化过程中逐渐失去对这些因素的依赖。血液污染，特别是红细胞污染，也会影响类器官的产生和基质的稳定性，因此通常采用标准方法通过裂解来消除这些物质。细胞在分离后，通常被种植到生物来源的基质中，例如基质胶或天然细胞外基质（例如胶原），或合成水凝胶中。基质胶主要由层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、粘连蛋白、珍珠蛋白和生长因子组成，其组成与基底膜相似。作为上文使用肠道类器官的例子的延续，现在简要描述细胞是如何被封装到基质中的。分离的肠道隐窝首先被重新悬浮在冷的基质胶中，然后移入预热的低附着孔板中进行培养，产生细胞-基质结构的扁平半球凝胶。类器官经过传代，扩增率通过从基质胶中分离类器官、移除单个细胞和计数隐窝来测量。扩增率的计算方法是每个孔中的类器官数量除以该孔中种植在基质胶中的初始隐窝数量。虽然基质胶可以支持类器官培养，但这种生物来源的基质固有的异质性和定义不明确的组成，几乎无法控制生化和生物物理时空线索，而这些线索对于改善类器官培养是必要的。因此，已经探索了其他具有确定组成的基质作为基质胶的替代，例如重组人胶原蛋白、纤维蛋白或合成水凝胶。天然基质可以从蛋白质或多糖中重组产生，以解决基质胶的批次间差异。另一方面，合成水凝胶已成为强大的工具，可以独立操纵生化和生物物理基质特性，以控制类器官特征和增强功能。理想的类器官基质应该整体上具有应力松弛和生化和生物物理特性的高度动态性，以适应或控制培养过程中类器官结构的变化。例如，基于聚乙二醇（PEG）的动态水凝胶最近被证明能够实现可再生肠道类器官的形成，并展示了如何调整水凝胶的性质以控制培养类器官的干性和分化。即使在使用合成基质培养类器官方面取得了许多进展，合成基质的类器官培养效率仍然低于基质胶培养的类器官。开发更好的基质的需求尚未得到满足。类器官培养基本上是基于积累的发育生物学知识，其中可溶性线索（soluble cues）以时空控制的方式呈现给细胞。在类器官培养中，这些可溶性线索以生物制剂的形式在体外重现，主要为生长因子等蛋白质或小分子药物，它们可以激活或抑制信号通路。虽然生长因子可能昂贵且不稳定，但许多小分子药物可以影响多个通路，导致重复性差，但一些类器官方案将生物制剂和小分子药物的使用相结合。使用来自工程细胞系的条件培养基，可以产生生物活性生长因子，例如L-Wnt-3A，可以替代常用的生长因子，例如WNT3A配体。但这些条件培养基面临着批次间差异的问题，需要严格的测试来确保可重复性。因此，新的替代分子开始出现，作为条件培养基的潜在替代品。考虑如何以及何时将可溶性线索添加到类器官培养物中至关重要，因为体内可溶性线索通常由细胞外基质或邻近细胞在时间和空间上协调地呈现给细胞，这就是时空呈现的概念。例如，现在已知成纤维细胞生长因子（FGF）的活性和特异性可以由细胞表面硫酸肝素蛋白多糖调节，这表明向细胞培养基中添加游离FGF可能无法再现FGF在体内组织中的可用性。以时空相关的方式呈现可溶性线索的重要性对于将iPSC培养成具有多种细胞谱系的复杂结构（例如肾脏类器官）尤其重要。根据以往的研究，已知输尿管上皮从早期迁移的胸膜前中胚层细胞发育而来。为了再现这一过程，研究了添加FGF之前初始Wnt信号不同持续时间的影响。可溶性因子的时空呈现可以使用不同的组织工程方法实现。一种策略是，这些生长因子可以被封装在纳米颗粒中，并结合到细胞表面进行可控释放。为了模拟某些生长因子在体内与细胞外基质结合的方式，研究人员将聚合物与肝素结合，肝素可以与生长因子结合，或者将这些生长因子结合到聚合物本身。表面锚定也可以用纳米技术实现，以模拟3D类器官培养的机制膜。最后，可以通过微流控系统来创建微型生态位，并精确控制其机械化学特性，通过气体或小分子的定向流动和梯度，这些系统可以精细控制类器官内的环境参数。除了生化线索外，还需要考虑何时以及是否有必要为培养的类器官提供适当的物理线索。营养供应和废物清除依赖于扩散，在类器官生长为更大的组织结构的过程中效率降低。这就是为什么肠道类器官需要被分解成更小的细胞簇并定期重新播种。营养和废物扩散不足在脑类器官培养中也是一个问题，由于营养无法进入，因此产生的毫米大小的结构往往在内核内出现坏死。这个问题可以通过摇动培养、旋转生物反应器或连续搅拌下的悬浮液，或在连续搅拌的生物反应器中部分解决。这些生物反应器可以监测pH、温度、氧和葡萄糖水平，以最大限度地提高质量转移，同时最小化剪切应力。在这方面，还开发了可灌注微流控芯片来促进类器官的长期培养。最后，考虑提供拓扑线索来控制体外类器官培养可能是有用的；基质的“地形”已知可调节细胞面积、形状和细胞-细胞相互作用，从而产生影响干细胞命运的生化信号。地形导向的形态发生已经通过在软水凝胶上生长的肠道类器官得到了证明。与原始的自组织类器官模型相比，上述线索可以整合，以更好地控制类器官的形态发生。线索的整合是组织工程领域常用的一种策略，用于构建体外和体内组织。理想情况下，特定的物理或化学线索应该使用简单、可重复和可靠的方法，以时空和生理相关的方式呈现。以肠道类器官为例说明这一点,在识别和分离隐窝中的LGR+肠道干细胞后，利用生物源性基质胶模拟富含层粘连蛋白的隐窝环境，并在细胞培养基中添加外源性生长因子。大多数肠道干细胞可以存活、增殖和形成类器官。然而，由于类器官发育的随机性，产生的类器官在大小、芽数量和功能上各不相同。在组织工程领域，线索的整合是一种常用的策略，用于构建体外和体内组织。在一个如何整合环境线索（机械和生化）来控制类器官形态发生的一个例子中，类器官成熟过程被分解为不同的阶段，并使用生物材料工程来确定每个阶段的最佳机械化学环境。结果表明，随着时间的推移，可以从高刚度切换到低刚度的机械动态基质使形态发生过程得以控制。还有其他工程方法也被用于类器官培养来控制细胞增殖、分化和形态发生。重建组织的一种流行的生物工程方法是生物打印。这项技术使用生物墨水，包括封装在生物材料中的活体类器官，以逐层方法精确地创建3D生物几何形状，以模拟天然组织的几何形状。最近的一个关于如何使用生物打印生成大型组织构造的例子是通过一种称为生物打印辅助组织的概念，使用人类小肠类器官形成自我进化的组织构造，其中厘米级肠道组织被连续打印，以模拟胃肠道的边界。重建组织，特别是跨不同组织和器官的另一种生物工程方法是使用微流控平台。微流控系统已被用于创建微型细胞模型，包括类器官，这些类器官重现了器官生理学的关键方面，称为器官芯片（organ-on-a-chip，OoC）。生物打印技术是一种用于重建组织的生物工程方法。OoC设备可以结合其他生物工程技术来模拟器官和组织的关键生理和结构特征。例如，使用合成支架将物理约束设计到类器官环境中，以提供物理边界。OoC设备还支持共培养或多器官系统。双器官系统已经通过使用包含不同组织构造的连接腔室来模拟肝损伤（使用肠上皮细胞和肝细胞）和2型糖尿病（使用人类胰岛和肝球状体）来模拟。最近，使用心脏和肝脏类器官制作了具有多个读数的双器官微流控设备。此外，OoC设备通过支持生理流速，改善了人类诱导多能干细胞来源的胰岛、肠道、胃和肝类器官的特性。肾脏类器官已经在OoC设备中培养，该设备能够使流体流动模拟剪切应力和血管网络的生成。评估培养的类器官是否能够再现代表性人体组织或器官的关键方面非常重要。为了实现这一目标，通常通过评估类器官的细胞组成、结构、功能和表型的稳健性来对这些类器官进行表征。类器官的生长是一个初始细胞聚集、增殖、迁移和分化的过程。在评估类器官是否已经成功建立时，首先确定类器官是否包含所需的细胞类型，以及类器官在体内准确模拟相应组织功能的程度至关重要。为了实现这一点，通常进行低通量基因表达验证和高通量全基因组转录组分析。实时PCR通常首先进行，作为指示细胞身份的标志基因的简单、快速和定量读出，包括关键转录因子和分化标志物。Western blotting提供了有关蛋白质丰度、蛋白质降解、蛋白质-蛋白质相互作用和翻译后修饰的进一步定量信息，这些信息代表了特定细胞类型中特定信号通路的活性。评估类器官组成最常用的工具是使用切片或全贴片的免疫荧光和免疫组化成像，特定细胞标志物的抗体染色进一步阐明了各种细胞类型的空间分布和比例。在全基因组转录组水平上对类器官中所有细胞类型进行高通量分析，然后将这些细胞类型与从相应组织或器官新鲜分离的细胞进行比较，以评估每个细胞群体的相似程度。考虑到体外培养的类器官包含不同状态的未成熟细胞，因此，从细胞分化状态的角度来看，scRNA-seq可以帮助确定类器官异质性的程度。对类器官形态进行评估，以确定培养的类器官与相应的体内组织或器官之间是否存在结构相似性。例如，对于胰岛等分泌组织，类器官内应存在胰岛样球状结构，并且预期还可观察到细胞内激素囊泡。对于分支上皮类器官，如乳腺类器官，预期应观察到明显的分支结构。对于肠类器官，应观察到隐窝样结构。对于包括合并支持细胞（如成纤维细胞和/或内皮细胞）的更复杂的类器官培养系统，预期合并的内皮细胞应形成血管网，重现类器官周围的内皮-上皮相互作用。类器官功能的评估包括但不限于成熟细胞的产生、血管或神经网络的形成、对外部刺激的准确反应以及细胞因子或激素的有效分泌等因素。类器官应与新鲜分离的组织作为阳性对照进行比较。对于不同的组织，需要离散的生理重现，例如胃类器官的酸分泌和肠类器官的粘液分泌。下表列出了评估类器官结构和功能的各种表征方法。在类器官研究中用于评估/表征类器官结构和功能的方法以小鼠胰岛类器官为例，讨论了各种表征和验证方法。通过免疫染色，通过相应激素的表达（胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽），检查了四种内分泌分化细胞类型（β细胞、α细胞、δ细胞和PP细胞）的形成。为了评估β细胞成熟的程度，通过透射电子显微镜成像对胰岛素分泌颗粒的超微结构形态计量分析。为了评估类器官β细胞对葡萄糖的反应能力，进行了葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验，例如使用胰岛素或C肽ELISA实验，循环高低葡萄糖孵育。由于胰岛素释放与钙动力学相关，钙信号迹象成像在葡萄糖反应中迅速增加并返回基线。为了测试胰岛类器官移植后的全部潜力，需要进行体内功能评估，以改善链脲佐菌素诱导的1型糖尿病小鼠模型的高血糖表型。特征参数包括血糖水平正常和稳定、血浆胰岛素水平正常和体重维持。肠类器官是体外成功建立的第一种类器官。经典的隐窝-绒毛样结构被认为是类器官建立成功的重要特征，具有良好的分支形态，具有强大的多细胞组成和位置，反映了类器官的分化和成熟水平。Lgr5标记的表达可以通过实时定量PCR或使用Lgr5荧光报告基因成像来分析肠干细胞的维持。分化细胞可以通过其标记物的染色来评估，包括溶菌酶（用于Paneth细胞）、绒毛蛋白（用于肠细胞）、黏蛋白2（用于杯状细胞）和嗜铬粒蛋白A（用于肠内分泌细胞）。这些不同的细胞类型也可以根据其特征性的亚细胞结构通过透射电子显微镜进行区分。功能性肠类器官由于成熟杯状细胞的黏液分泌而表现出相对厚的黏液层，这可以通过阿利新蓝和过碘酸-希夫染色来检测。在肝脏中，已从小鼠和人类组织样本中建立了胆管细胞和肝细胞类器官。通过测量类器官细胞的传代时间和增殖来评估肝类器官。在标记物表达方面，在RNA水平和蛋白水平上评估特异性胆管细胞标志物（例如KRT19、KRT7、SOX9）或肝细胞标志物（例如ALB、HNF4A、MRP4）。通常还使用肝祖细胞标志物（例如LGR5）来评估培养细胞的分化状态。为了评估类器官的功能，进一步在RNA水平上分析肝细胞的标志物，如CYP3A4和CYP3A11。此外，通过过碘酸-希夫染色评估白蛋白分泌、低密度脂蛋白摄取、糖原积累的存在，使用化学分析评估胆汁酸产生和肝酶（例如CYP3A4）的活性，以确认肝细胞功能。通过透射电子显微镜也经常评估类器官的超微结构，以观察典型的肝细胞或胆管细胞形态。最后，为了对功能进行最终测试，通常将类器官移植到FRG免疫缺陷小鼠体内，以观察移植物的体内整合和功能。患者来源的肿瘤类器官必须保持来源组织的基因组、转录组、形态学和功能特征。因此，通过与来源组织的组织学和免疫组化特征、转录组学以及基因组学进行比较，对肿瘤类器官的验证非常重要。肿瘤类器官的细胞组织、组织结构和蛋白表达模式可以很容易地与来源癌症进行比较。同样，类器官的基因表达谱应该与其来源的肿瘤相似。这已经在许多肿瘤类型的RNA-seq中得到证实。最后，重要的是要确认肿瘤类器官是否在基因组水平上与患者肿瘤发生了分歧。一些研究表明，类器官和母体组织在突变和拷贝数变异方面是一致的。更大程度的差异可能归因于肿瘤内的空间异质性和抽样偏差：肿瘤可能具有空间多样性，从特定部位产生的类器官可能缺乏远端区域的代表性。除了这种拓扑学问题，培养条件可能有助于选择特定的克隆，随着时间的推移可能改变或减少克隆性。
当长期培养时，肿瘤类器官的验证就更加关键。虽然一些研究报告了分子特征可以在长期培养中保持，但其他研究观察到连续传代后的肿瘤演变。例如，肝癌类器官的外显子组测序显示，突变一致性从培养不到2个月的类器官的92%下降到超过4个月的类器官的80%。从微卫星不稳定肿瘤建立的大肠癌类器官在长期培养后比稳定肿瘤有更高的新生突变。观察到的一些差异可能归因于不同的克隆和亚克隆在培养中如何适应和扩大。使用500个癌症相关基因的深度靶向测序，表明保留了干突变，而亚克隆突变随着每一代的突变变化而获得或失去。大多数突变和拷贝数变异在肺癌类器官的晚期传代中保留下来，而新生突变可归因于原发肿瘤中小亚群细胞的亚克隆扩增。总的来说，这些研究表明，在长期培养的类器官中可能发生遗传漂变，影响其作为功能和药物发现研究模型的可靠性。这重申了在肿瘤类器官建立、表征和测试中验证的重要性。最后，正常组织污染是建立肿瘤类器官的一个问题，在验证患者来源模型时应予以解决。正常细胞的存在可以通过组织学比较和免疫组化以及测序来估计。类器官作为一种基于细胞的工程模型，可以再现相关生理结构和功能，在基础研究和临床应用方面都显示出巨大的潜力。组织来源的类器官可以成为再生医学可移植材料的潜在来源。小鼠肠道、肝脏和胰腺的类器官已经成功地移植到小鼠体内，并帮助器官功能得以恢复。例如，从小鼠肝脏分离的肝细胞中产生肝脏类器官，这些类器官被注射到富马酸乙酸水解酶（Fah）缺陷的小鼠体内，这种缺陷会导致肝损伤，在停止使用保护肝脏的尼替西酮药物治疗后，小鼠的生存期很短，仅有40天。而在尼替西酮治疗中断后，植入肝脏类器官的小鼠存活超过100天。同样，在人工细胞外基质中培养的胰岛可以成功植入链球菌素诱导或自身免疫驱动的糖尿病小鼠模型中，恢复胰岛素的产生并逆转高血糖。除了小鼠类器官，从肝脏样本中提取的EpCAM+导管细胞来源的人类肝脏类器官已经植入了诱发急性肝损伤的免疫缺陷小鼠。人类胰腺类器官可以从ALDH高表达干细胞中产生，并有可能产生胰岛素。肠类器官已被证明融合成类似于体内肠道的管状结构。在具有可调生物降解性的人工细胞外基质中，也可以产生更复杂的肠类器官。尽管将类器官用于再生医学还有很长的路要走，但已经建立了产生正常组织类器官的改进方案，以及确保高可重复性、移植和功能的良好制造规范。近年来，3D类器官快速高通量筛选的技术挑战已经得到解决，并通过不同的方法克服对卵巢或腹膜肿瘤患者来源的类器官进行240种酪氨酸激酶抑制剂筛选，在手术后一周内提供了个体化药物敏感性谱。还可以通过肿瘤类器官从结构相似的候选药物中选择有效药物，并研究不同药物联合治疗的协同作用。活检样本或手术切除样本中邻近正常组织的非肿瘤细胞可用于开发对照健康类器官，以确认试验药物的肿瘤特异性疗效。可以用设计表达针对不同新抗原的嵌合抗原受体的免疫细胞库筛选类器官。免疫检查点抑制剂和其他免疫肿瘤药物也可以在包括免疫细胞的肿瘤类器官模型中进行筛选。由于类器官可以保持其来源组织的基因组图谱，因此药物筛选可用于提供基因突变与药物反应之间的联系。通过对来自7例患者的胃癌类器官进行37种药物的筛选，发现ARID1A突变的肿瘤对ATR抑制剂敏感，这支持了之前的研究，并从功能上确定了对一类被认为不可成药的基因突变的干预。人们对为每位患者量身定制癌症治疗越来越感兴趣。精准医学通常是基因组学的同义词。然而，几项临床试验表明，只有一小部分患者具有可操作的基因组改变可以与特定干预相结合。在评估大规模实施测序驱动疗法的NCI-MATCH试验中，仅约37%的患者被发现具有可操作的突变。这项和其他精准医学试验表明，许多靶向干预的临床益处有限，应答率适中，揭示了很大程度的复杂性。虽然基于基因组学的精准医学干预的临床疗效有待讨论，但很明显，大多数癌症患者没有可操作的基因来指导治疗。功能性精准医学——基于检测患者肿瘤的药物反应以确定治疗方案——已被提出为一种更直接的替代方案，因为它不需要任何肿瘤分子特征或其他特征的先验知识。类器官非常适合功能性精准医学，因为它们易于建立，与来源组织具有高度相似性，易于处理，并且已在许多肿瘤中识别和确定治疗靶点，包括在分子水平上往往研究不足和特征不明显的罕见癌症。最近，从患者来源的异种移植物建立的类器官被用于确定艾立布林（eribulin）作为复发性三阴性乳腺癌患者的治疗药物，在治疗期间，患者的无进展生存期比之前接受的治疗延长了3.5倍，这表明了类器官在临床应用中的潜力。类器官越来越多地被用作种子材料，以产生具有更好的植入率的异种移植物。这一过程涉及使用完整的类器官或消化后的单个细胞。通过CRISPR-Cas9基因编辑携带APC、SMAD4、TP53、KRAS和/或PIK3CA突变的人肠类器官被作为种子植入免疫缺陷小鼠的肾包膜下间隙。其中，携带一个或两个基因突变的良性类器官被证明不能形成肿瘤，而携带四个或五个基因突变的类器官可成瘤。患者来源的类器官也可以产生异种移植物，证实其致瘤能力并重现亲代肿瘤的组织学。在一项结直肠癌的研究中，良性肿瘤类器官在小鼠体内没有或很少植入。相比之下，来自转移的结直肠癌类器官比来自原发肿瘤的类器官更具侵袭性。对体外培养的多形性胶质母细胞瘤细胞形成的异种移植物的形态学比较表明，来自肿瘤球的细胞显示实体瘤生长模式，其类器官则更具扩散性，类似于原发肿瘤。来自腔内起源的膀胱肿瘤的类器官系移植到小鼠体内，显示出具有相同腔内表型的肿瘤。类器官模型现在被广泛用于宿主-病原体相互作用的研究。例如，来自肠道、肝脏、肺、口腔黏膜和胃等组织和器官的类器官已经与细菌、病毒和寄生虫177等病原体共培养。在人肠类器官中，分化肠细胞比未分化肠细胞更容易受到人轮状病毒（HRV）感染。感染HRV或轮状病毒肠毒素的类器官表现为腔隙肿胀，这是轮状病毒诱导腹泻的特征。人肝脏类器官被用作药物筛选平台，以测试抗HRV药物和抗体，发现霉酚酸、IFNγ和抗轮状病毒VP7抗体能够在体外阻止轮状病毒复制。类器官也可以用于致癌病原体的研究。幽门螺杆菌感染小鼠胃类器官显示由细菌源性CagA诱导的胞质β-连环蛋白水平增加，导致感染类器官增殖增加。自COVID-19大流行开始以来，许多实验室已经研究了SARS-CoV-2对类器官的影响。SARS-CoV-2可感染的远端肺类器官是由表达ACE2的腔隙细胞介导的。SARS-CoV-2被发现以杯状细胞为靶点，而不是纤毛细胞，这与之前在二维空气-液体界面模型中进行的研究相反。对肠类器官的研究表明，SARS-CoV-2也可以感染肠细胞，CRISPR-Cas9和药物筛选表明，敲除TMPRSS2或TMPRSS4，或使用卡莫他特（Camostat）治疗，可以减少病毒感染。类器官在模拟和研究各种不同器官的常见和罕见疾病方面已经显示出显著的实用性。囊性纤维化是由CFTR基因突变引起的遗传性疾病，已报道了2000多个与囊性纤维化相关的CFTR突变位点，但临床上部署的小分子治疗仅针对其中的一小部分。CFTR突变导致多器官功能障碍，影响肺、胰腺、肝和肠道。结肠、肝脏和胆管、直肠、呼吸系统和小肠的囊性纤维化类器官模型已经从小鼠模型或患者相关器官的成体干细胞中获得，其应用范围从研究疾病生物学到反映患者的药物反应。一种CFTR激活剂Forskolin已被用于诱导由于氯离子和液体流入腔内而引起的类器官肿胀，患者来源的直肠类器官肿胀的减少与患者的临床反应参数相关，这可以模拟对特定治疗方案的个体化临床反应。囊性纤维化类器官也被用于研究基因治疗干预，并能够利用CRISPR-Cas9挽救肠道类器官中CFTR突变的影响。炎症性肠病如溃疡性结肠炎和克罗恩病也已用类器官模型进行研究。尽管保留了相似的形态学，但来自炎症性肠病患儿肠上皮细胞的类器官具有炎症性肠病特异性DNA甲基化特征。还可以生成肝类器官以模拟肝病，例如α1-抗胰蛋白酶缺乏症、阿加曲尔综合征和原发性硬化性胆管炎。获得的3D类器官系统的形态和功能的可重复性仍然是当前类器官研究一个主要瓶颈。该综述详细阐述了类器官研究的局限性和最新进展，为开发、表征和标准化类器官系统提供了一条更优化的管线。目前的类器官模型系统均无法再现其各自器官的细胞类型、成熟度和/或功能的完整生理谱系；相反，它们只能表现出其主要形成的组织的某些功能。绝大多数组织来源的类器官模型缺少组织特异性细胞类型，包括生态位特异性间充质、免疫细胞、血管化、神经支配或微生物组。最近，导管细胞-肝脏间充质细胞共培养已被证明可以重现部分肝门管结构。特别具有挑战性的是，并非所有细胞类型都有相同的增殖率、生长因子需求，甚至对氧暴露的需求。多能干细胞来源的类器官在重现发育器官的不同细胞类型和细胞相互作用方面表现更好，但无法表现成人组织结构和功能以及细胞成熟。一种有效的策略是体内移植。然而，这需要放弃对形成的组织构造的控制。同时，优化分化方案，丰富成熟度和特定功能。另一个导致成熟度和功能受限的因素是空腔腔内死细胞的营养可及性和积累。这对诱导多能干细胞来源的类器官尤其重要。随着类器官的大小增长，对位于类器官中心的细胞的营养供应受到限制，导致细胞死亡。这在形成更紧密结构的类器官中很常见，例如脑类器官。对于形成空腔囊的组织来源类器官（胆管细胞，胰腺），死细胞最终将开始在腔内积累，这无法避免，但可以通过类器官的机械碎片来解决。形成的结构的持续碎片阻止了长期研究的开展。然而，多能干细胞来源的类器官不能被碎片和传代；正在开发解决营养可及性问题的新策略，包括体外脑切片的长期维护。一旦细胞形成类器官，我们对类器官内的细胞行为的了解就很少。即使在相同的实验设置中，结果也往往是过多的表型特征（形状、大小、细胞组成）。优化形态梯度、组织特异性细胞-ECM相互作用以及局部生化和生物物理特性对于最大限度地减少批间异质性至关重要。为了生成更复杂的多细胞成熟和功能结构，类器官领域已经开始创建组装体，例如人类皮质运动组装体。这种努力允许创建更复杂的结构，用定义的界面连接多种类型的组织，如用神经肌肉接头连接大脑皮质、脊柱和骨骼肌，但代价是可重复性。对器官内异质性的有限控制不利于高通量筛选应用，并使需要高时空分辨率成像的研究变得困难。与其创建更复杂的器官样系统，不如采用更简单的缩小尺寸的模型来重现感兴趣的基本组织结构和功能，这种趋势正在增强。以有几种工程方法被用于优化上述限制，克服使用非特异性细胞外基质（例如基质胶）的主要途径有两种：一种是使用对组成和刚度有更完全控制的合成基质，另一种是采用脱细胞组织并创建组织特异性基质。人们做出了重大努力，以确定化学定义的、GMP兼容的细胞外基质，使人类类器官的生长和长期扩增成为可能。在这方面，人类胰腺类器官、肠类器官和结直肠癌类器官取得了一些进展，它们可以在基于葡聚糖的的细胞外基质中生长，然而，它们不会在其中实现长期扩增。已有研究表明，通过最大限度地提高可溶性微环境中的质量转移和最小化剪切应力，在器官芯片设置中生长的细胞上调了其功能，更接近于天然组织。最近的一个例子表明，流体流动增强肾脏类器官的成熟，并有利于体外血管化。通过在相同大小的隐窝中自组织的工程支架提供边界，在类器官环境和肠细胞中设计了物理约束。同时，通过创建一个可灌注的迷你肠培养物，细胞被安排成管状上皮和与体内组织相似的空间排列，它们克服了囊性类器官的不可及性和细胞碎片的清除。展望未来，趋势是开发更复杂的类器官模型，尽可能忠实地再现器官在体内结构和功能，包括随着时间的推移再现细胞类型、组织结构、可测量的分子事件和表型功能。与其专门关注最突出的标志物或功能性检测，还应该对原生组织进行结构基准测试。以肝细胞类器官为例，肝细胞功能得到保留，但肝组织结构与肝细胞呈条索状排列的原生组织不匹配。同样，胰腺或结肠癌类器官等类器官各向同性生长，形成囊状，而不是在原生组织中形成的管状结构。为了获得更复杂的功能，具有多细胞和多组织结构的类器官将非常重要，特别是在研究细胞-细胞相互作用的情况下。顺着这一思路，组装体和芯片器官也变得越来越复杂，并被更广泛采用。除了在创造更生理学相关、更健壮和更易使用的类器官模型方面的技术进步外，预计将在应用中看到类器官产生更大的影响。在过去的20年里，尽管已经讨论过取代动物试验，但这些努力尚未导致具体行动，然而，这正在迅速改变。能够在体内再现复杂生理功能的类器官也增强了人们的信心，认为新的替代方法现在是可行的选择。在人类类器官中将有更多的动物研究结果外推，以更好地理解人类生物学和病理生理学，预计将广泛采用类器官作为细胞来源，用于细胞治疗、再生医学、体外诊断和药物发现。
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