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尽管定制的序列特异性蛋白酶具有发展生物技术和医学的潜力，但是具有定制的切割特异性的蛋白酶的产生仍然是主要的挑战。2021年2月19日，博德研究所刘如谦(David R.Liu)及哈佛医学院Dong Min共同通讯在Science 在线发表题为”Phage-assisted evolution of botulinum neurotoxin proteases with reprogrammed specificity“的研究论文，该研究开发了具有同时阳性和阴性选择的噬菌体辅助蛋白酶进化系统，并将其应用于三种肉毒杆菌神经毒素（BoNT）轻链蛋白酶。该研究将BoNT / X蛋白酶进化为单独的变异体，这些变异体优先裂解囊泡相关膜蛋白4（VAMP4）和Ykt6，进化了BoNT / F蛋白酶以选择性裂解非天然底物VAMP7，并进化了BoNT / E蛋白酶以裂解磷酸酶和肌腱同源蛋白（PTEN），但不是神经元中的任何天然BoNT蛋白酶底物。进化的蛋白酶显示出特异性的大变化（218倍到 11,000,000倍），并且可以保留其形成自我递送至初级神经元的全毒素的能力。这些发现为重新编程蛋白酶建立了通用平台，以选择性地切割具有治疗意义的新靶标。
蛋白酶高效，高特异性地切割蛋白质靶标的能力使它们在生物学，生物技术和医学中发挥重要作用。通过重新编程蛋白酶以选择性切割不存在已知蛋白酶的新靶标的能力，可以大大扩展蛋白酶的应用。尽管已对蛋白酶进行了改造或改良以提高稳定性，耐溶剂性，抑制剂抗性，活性和特异性改变，但成功改变了底物特异性，还是非常少报道。尽管蛋白酶进化过程中的负选择降低了单个氨基酸底物变化的脱靶活性，但是定向进化将蛋白酶从其原始底物中广泛地重新编程以实现新靶标的高特异性裂解的能力的局限性仍然很大。许多病原体已经进化出蛋白酶，该蛋白酶可以精确地裂解蛋白质来精确调节宿主细胞的功能。这些蛋白酶以肉毒杆菌神经毒素（BoNT）为例，已被证明是强大的治疗剂。BoNT是一类具有7种主要血清型（BoNT / A至BoNT / G）的细菌毒素。每个BoNT包含通过二硫键连接的重链（HC;〜100 kDa）和轻链（LC;〜50 kDa）。 HC充当传递载体，既包含受体结合域又包含膜易位域，而LC是锌依赖性金属蛋白酶。BoNT HC介导进入神经元胞质溶胶，其中二硫键还原释放LC。BoNT LC的已知底物是SNARE蛋白家族的所有成员，它们介导真核细胞中的膜融合。LC靶向并选择性切割对于突触小泡胞吐作用必不可少的SNARE蛋白。BoNT / A，BoNT / C和BoNT / E裂解25 kDa突触体相关蛋白（SNAP-25）；BoNT / B，BoNT / D，BoNT / F和BoNT / G切割与囊泡相关的膜蛋白1、2和3（VAMP1，VAMP2和VAMP3）; BoNT / C也可切割Syntaxin-1。这些蛋白质的切割阻断突触小泡胞吐作用，引起肌肉麻痹。BoNT因其美容用途而广为人知，但30多年来，它们也已被用作重要的治疗性蛋白质来治疗许多其他病症。BoNT LC蛋白酶的出色选择性对于其治疗应用至关重要。过去设计BoNT LC的努力扩展了其裂解同源SNARE蛋白质的能力，但无法重新靶向这些蛋白酶以选择性裂解与其天然底物相差甚微的蛋白质。例如，工程化的BoNT / A和BoNT / E蛋白酶裂解SNAP-23，但保留对SNAP-25的活性。由于它们的高特异性以及构型变化以介导底物识别和裂解，重新编程BoNT蛋白酶以裂解SNARE家族成员之外的蛋白质的前景似乎遥不可及。尽管已经报道了几种蛋白酶进化系统，但噬菌体辅助连续进化（PACE）特别适合应对这一挑战，因为PACE持续多样化并选择具有所需特性的基因变体，比逐步蛋白进化方法快约100倍。最近报道了蛋白质裂解的PACE选择，并使用该选择来进化可在人白介素23中裂解序列的烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶。由于该PACE系统无法针对脱靶裂解活性进行选择，因此进化出的TEV蛋白酶在其天然底物上保持了强大的活性。在这里，该研究开发了一种同时PACE阳性和阴性选择系统，并用它来重新编程三种BoNT LC蛋白酶的底物特异性，从而产生了四种对其新靶标具有高特异性的蛋白酶。这些结果建立了快速进化一类临床蛋白酶以优先切割非天然靶标的系统。该研究将BoNT / X蛋白酶进化为单独的变异体，这些变异体优先裂解囊泡相关膜蛋白4（VAMP4）和Ykt6，进化了BoNT / F蛋白酶以选择性裂解非天然底物VAMP7，并进化了BoNT / E蛋白酶以裂解磷酸酶和肌腱同源蛋白（PTEN），但不是神经元中的任何天然BoNT蛋白酶底物。进化的蛋白酶显示出特异性的大变化（218倍到 11,000,000倍），并且可以保留其形成自我递送至初级神经元的全毒素的能力。这些发现为重新编程蛋白酶建立了通用平台，以选择性地切割具有治疗意义的新靶标。DOI: 10.1126/science.abf5972
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