撰文｜胡婧（电子科技大学医学院），钱浩（加州大学圣地亚哥分校）
2020年6月24日，加州大学圣地亚哥分校付向东团队在Nature 发表题为：Reversing a model of Parkinson’s disease with in situconverted nigral neurons 的研究论文。
该研究发现在星形胶质细胞中敲降RNA结合蛋白PTB可将其直接转分化为功能性的神经元；这种仅需一步的转分化技术可在帕金森病小鼠模型中诱导产生新的多巴胺功能性神经元、重建受损的神经环路、恢复纹状体内多巴胺水平，并有效治疗帕金森综合征相关的运动障碍；更重要的是，使用抑制PTB的反义寡核苷酸（ASO）也能达到类似治疗效果。
这项研究为帕金森病及其他神经退行性疾病提供了极具前景的治疗策略和方法，并获得了神经科学领域的广泛关注。该研究还被选为Nature 的封面文章。
封面制作：苟兰涛／goandy@163.com
瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所Ernest Arenas在Nature 发表了题为：Method to combat Parkinson’s disease by astrocyte-to-neuron conversion 的点评文章，该文章系统点评了该研究成果，同时指出该研究有望为神经系统疾病（如帕金森氏病）的再生医学的发展开辟新的篇章。
神经退行性疾病是老龄化社会中人群健康的主要威胁之一。以帕金森病（Parkinson’s disease）为例，全世界已有超过一千万的患者，而目前所采取的药物和手术治疗只能延缓疾病恶化而不能彻底治愈。若要从根本上恢复患者的生理功能，则需体外移植或原位再生新的神经元。然而，利用诱导型多能干细胞（iPSC）分化的神经元进行移植治疗存在整合难、癌变性和免疫原性等问题。因此，从胶质细胞直接进行神经元原位转分化（trans-differentiation）将可能是根治神经退行性疾病的有效策略。不同于在胶质细胞中过表达神经元特异转录因子以诱导神经原位再生的“加法”策略，付向东教授提出了“减法”策略，即通过在非神经元细胞中敲降一个在神经分化过程中自然下调的关键抑制因子—RNA结合蛋白PTB—来诱导生成神经元，该方法更为简便、安全、易操作。付向东教授是RNA功能基因组学领域的领军人物，而十年前一个偶然的发现将他引领到神经退行性疾病治疗方法研发。2009年，付教授的博士研究生薛愿超（现任中国科学院生物物理研究所研究员），在研究PTB在细胞内调控RNA剪切的位置效应和分子机制时无意中发现，稳定敲降PTB的HeLa细胞长出了类似神经元的突起；深入研究发现，PTB敲降后的小鼠成纤维细胞可以转变成功能性的成熟神经元，该项工作于2013年在 Cell 杂志上发表。随后，薛愿超研究员与付实验室博士后钱浩博士通力合作，于2016年又在 Nature Neuroscience 杂志上发表了人源成纤维细胞到神经元转分化的研究论文，阐明了人源细胞神经元转分化过程中需要以PTB和nPTB为主的两个调控环路。在此基础上，钱浩博士等人在北京大学周专教授和西南医科大学康新江教授的鼎力协助下，经过不懈努力，终于实现将小鼠星形胶质细胞（astrocyte）敲降PTB、原位转分化为功能性神经元，并证实了“减法”策略对帕金森病模型小鼠有显著疗效。这一激动人心的工作于2017年12月第一次投稿到 Science，其后又根据多方建议补充了大量实验数据，并于2018年11月投稿到 Nature，在今年5月被正式接收。从2017年9月至今，付向东教授一直秉持开放的科学态度，在国内外多个研究机构和学术大会分享了该项研究的实验设计和研究成果。特别是在2018年6月，付教授受邀中国科学院上海神经科学研究所介绍这项研究工作，引起了国内神经科学领域的高度关注，并获得广泛好评。在这篇论文中，作者首先发现，分离的小鼠或人源星形胶质细胞在敲降PTB之后，可高效转分化为表达TUJ1和MAP2标志蛋白的成熟神经元，且这些神经元是有功能性的，具备神经特异的钠电流和动作电位，并可检测到突触后电流（图1）。图1. PTB敲降可诱导小鼠星形胶质细胞转分化为成熟的功能性神经元（图源自Nature ）在得到体外实验证据后，作者构建了腺相关病毒（AAV）载体，利用星形胶质细胞特异的启动子GFAP驱动PTB shRNA表达，并利用共表达的红色荧光蛋白进行示踪；将腺相关病毒注射到中脑（midbrain）后，发现在星形胶质细胞中实现了PTB的敲低，进而诱导神经元转分化；由于受脑区微环境的影响，在中脑转分化生成的神经元中有许多是表达TH的多巴胺能神经元。基于此，作者选择6-OHDA引发损伤的帕金森病小鼠模型，验证此策略原位再生多巴胺能神经元，发现新生的神经元可正常分泌多巴胺（图2），并使小鼠受损的运动行为恢复正常。图2. 小鼠中脑星形胶质细胞敲降PTB转分化为多巴胺能神经元（图源自Nature ）为了确认由星形胶质细胞原位转化而来的新生神经元是否重建了受损神经通路，作者利用荧光微粒（retrobeads）逆向示踪技术，验证了新生神经元从中脑黑质（substantia nigra）到纹状体（striatum）的投射（图3a）；并且又引入化学遗传学技术（DREADD）操控转分化神经元，观察到小鼠相应的运动行为取决于新生神经元的功能是否正常（图3b）。这一系列实验结果，有力地证明了转分化诱导的神经元重建了受损的黑质－纹状体通路，逆转了神经损伤所带来的功能障碍。图3. 转分化神经元可以有效整合并重建远程神经通路连接。 （a）荧光微粒逆向示踪技术显示新生神经元的远距离连接；（b）化学遗传技术模型进一步验证新生神经元重建通路恢复功能（图源自Nature ）。除了利用腺相关病毒之外，作者还尝试给帕金森病小鼠注射抑制PTB的反义寡核苷酸，发现其同样能促进从星形胶质细胞到神经元的转分化（图4a），并且有效地逆转了小鼠运动缺陷的症状（图4b）。这些发现不仅证实了反义寡核苷酸在诱导神经元转分化方面的有效性，还为开发帕金森病相关药物奠定了坚实的基础。图4. PTB反义寡核苷酸也可以逆转帕金森病小鼠症状。（a）PTB反义寡核苷酸在体外或体内诱导神经元转分化并表达泛神经元和多巴胺能神经元特异标志蛋白；（b）PTB反义寡核苷酸有效地缓解帕金森病小鼠运动障碍表型（图源自Nature）。综上所述，付向东教授团队利用腺相关病毒shRNA或反义寡核苷酸药物降低PTB水平，成功地在帕金森病模型小鼠的中脑，将星形胶质细胞转分化为多巴胺能神经元，并有效地逆转了小鼠运动障碍的症状。无独有偶，今年4月中国科学院上海神经科学研究所杨辉组在 Cell 杂志上也发表了相关论文，他们以CRISPR-CasRx系统介导了Ptbp1敲低，分别在小鼠视网膜和大脑纹状体里将胶质细胞转变为视神经节细胞和多巴胺能神经元，进一步佐证了“减法”策略在治疗神经退行性疾病中的可行性。图5. 通过敲低PTB将星形胶质细胞原位转化为黑质神经元，可以逆转小鼠帕金森综合征病症，并有望拓展到其它神经退行性疾病的研究及治疗（图源自Nature ）。付实验室这项突破性研究工作历经十年，从生物学现象入手，首先详细解析了以PTB为核心的神经元分化调控机制，然后再从理论探索逐步推进到疾病治疗相关的临床转化上，展示了基础研究的无穷魅力和重要性。付向东教授表示："当前的目标是尽快将这一技术推向临床试验，测试其对帕金森综合征患者的治疗效果。与此同时，我们也计划针对其他因神经元损失而导致的神经退行性疾病进行类似的研究，包括阿尔茨海默症，亨廷顿舞蹈症和中风等，我打算用余生全力以赴这些研发工作。”https://www.nature.com/articles/s41586-020-2388-4