基因治疗:耳蜗毛细胞再生的新兴疗法

​感觉神经性听力损失通常是由耳蜗毛细胞(HCs)受损引起的，耳蜗毛细胞受损是由于外部刺激或由于人的遗传因素以及不能将声音机械能转化为神经冲动。成年哺乳动物耳蜗HCs不能自发再生；因此，这种类型的耳聋通常被认为是不可逆的。对前体细胞分化发育机制的研究表明，在特定基因过度表达后，耳蜗中的非感觉细胞获得分化为前体细胞的能力，例如Atoh1，这使得HC再生成为可能。基因疗法，通过在试管内选择和编辑靶基因，将外源基因片段转化到靶细胞中，并改变靶细胞中基因的表达，以激活靶细胞中相应的分化发育程序。本文综述了近年来与耳蜗毛细胞生长发育相关的基因，并对毛细胞再生领域的基因治疗方法进行了综述。最后讨论了当前治疗方法的局限性，以促进这种疗法在临床环境中的早期实施。

1.介绍

耳聋是人类最常见的神经系统疾病，已经严重影响了人类的正常生活。根据世界卫生组织发布的《世界听力报告》，全球几乎有15亿人存在不同程度的听力损失，4.3亿人处于需要康复的重度听力损失水平(Chadha等人，2021年).耳聋可分为传导性耳聋、感音神经性耳聋和混合性耳聋(坎宁安和图奇，2017年).更常见的耳聋类型是由耳蜗毛细胞(HCs)死亡或功能丧失引起的感觉神经性耳聋。HCs是内耳感觉细胞中对声音感知和传递最关键的细胞，其功能是将来自环境的声音的机械信号转化为神经系统可以感知的电信号(院长，2021).HCs是哺乳动物内耳感觉上皮中最重要的细胞。研究表明(藤冈等人，2015年)与非哺乳动物(鸟类和爬行动物)相比，HCs在哺乳动物体内不能自发再生；因此，HC损伤经常导致永久性听力损失。

作为一种治疗方法，基因治疗包括通过载体将外部正常或治疗基因转移到体内的靶细胞，使靶细胞表达相关基因或修饰相关基因。它现在已经成为一种潜在的治疗遗传性耳聋的方法。在一些动物模型中，基因治疗已经用于转移一些基因，例如Syne4 (Taiber等人，2021年)，Tmc1(Marcovich等人，2022年)，以及Clarin-1 (杜隆等人，2018年)进入耳蜗，并显著改善了研究动物的听力损伤程度。在内耳毛细胞的发育分化和成熟过程中，也有多个基因的调节(Bermingham等人，1999年; Hertzano等人，2004年; Ikeda等人，2015年; 侯等，2019; 丁等，2020; Jen等人，2022年)和信号通路(贝尼托-冈萨雷斯和多兹尔霍弗，2014年; Waqas等人，2016年; Ebeid和Huh，2017; 白等，2021).通过干扰这些，可以恢复HCs的正常分化，并且可以刺激支持细胞(SCs)再分化并产生HCs(梅嫩德斯等人，2020年).目的是治疗与HC损伤相关的听力损失。在这篇综述中，我们强调了基因治疗如何促进毛细胞再生，以减轻患者的听力损失，并对该领域的未来研究进行了展望。

2.HC发育相关转录因子

在内耳发育期间，许多转录因子，包括Atoh1，参与了HCs的增殖和分化(图1).在内耳发育的小鼠模型中，Atoh1在胚胎期(E) 13.5 d的基础祖细胞中首次表达，至E17.5耳蜗螺旋成熟时逐渐增加，出生后(P) 0 d后逐渐减少，P7后，Atoh1无法测量螺旋中的表达式(Lumpkin等人，2003年; 科坦切和凯泽，2010年; 蔡等，2013).相比之下，的变化Atoh1-相关下游目标因子Gfi1与变化相一致Atoh1，其在E12.5开始表达，并且随着胚胎期的结束表达也逐渐减少(Wallis等人，2003年).相反地，Pou4f3和Barhl1仅在E13.5和E14.5时在耳蜗基底HCs中检测到，并并且随着胚胎期的结束表达也逐渐减少(Wallis等人，2003年).相反地，Pou4f3和Barhl1仅在E13.5和E14.5时在耳蜗基底HCs中检测到，并在出生后继续表达(向等，1997; 侯等，2019; 图2).

2.1.Atoh1

Atoh1，也称为Math1是螺旋-环-螺旋(bHLH)家族转录因子，编码序列为1.053 kb，编码大小为17.9 kDa的蛋白质。Atoh1是在分化的肝细胞祖细胞中鉴定的第一个转录因子，并且是肝细胞生长和分化所必需的(Bermingham等人，1999年).在…里Atoh1突变小鼠，所有内耳感觉区不分化产生HCs(潘等人，2011年).进一步的研究揭示了HCs对Atoh1随着耳蜗中感觉细胞的发育和成熟而减少(Chonko等人，2013年).然而，HCs并不是不受以下因素的影响Atoh1耳蜗生长后，作为Atoh1缺乏还会破坏听觉系统的标准毛束结构，并最终导致HCs的延迟死亡(蔡等，2013; 程等，2016).相比之下，增强的表达Atoh1促进HCs的正常发育，改善听力(Izumikawa等人，2005年; 罗等，2022).因此，整个听觉系统，从发育期到成熟期，都离不开听觉的调节Atoh1.

2.2. Atoh1下游目标因素Pou4f3, Gfi1，以及Barhl1

由于…的重要性Atoh1在HCs中，确定以下下游目标因素Atoch1对研究发育机制至关重要。Atoh1在小鼠小脑中鉴定目标组，并使用全基因组研究耳蜗发育Atoh1测序方法(Klisch等人，2011年; 蔡等，2015).直接的Atoh1靶基因Pou4f3, Gfi1，以及Barhl1与HCs的正常分化和再生有关(Wallis等人，2003年; 钟等，2018; 陈等，2021).这Atoh1目标群体已确定在耳蜗。

Pou4f3是Pou家族转录因子，是显性非综合征性耳聋15 (DFNA15)致聋基因(Vahava等人，1998年)和下游目标Atoh1激活(Ikeda等人，2015年).在HC分化期间，存在以下之间的前馈协同作用Atoh1和Pou4f3，与Atoh1第一次刺激Pou4f3表达式，它释放Atoh1相关元件处于闭合状态以激活一系列HC特异性增强子(于等，2021). Gfi1是一种锌指转录因子。研究表明Gfi1表达受以下因素调节Pou4f3 (Hertzano等人，2004年). Gfi1在HCs发展的早期抑制神经元基因的表达，并且在缺乏Gfi1耳蜗成熟停滞(Matern等人，2020年). Barhl1是一种BarH样同源结构域转录因子，在耳蜗中的所有HCs中明确表达(Bulfone等人，2000年).缺少老鼠Barhl1出现了严重的与年龄相关的听力损失。进一步的研究发现，HC死亡在Barhl1-无效小鼠在出生6天后开始，并在几个月内缓慢发展(李等，2002)，暗示着Barhl1可能参与HCs的终末分化和长期维持。

总之，Atoh1是HCs形成过程中的关键转录因子Atoh1突变体失去产生HC祖细胞的能力；Pou4f3和Gfi1的下游基因Atoh1，是祖细胞发育成熟为HCs所必需的，HCs的延迟变性发生在Pou4f3和Gfi1变种人；Barhl1与HCs的长期维持有关。在…里Barhl1突变体，HCs成熟但最终在一定时期内死亡。

2.3.Foxg1

Foxg1是FOX家族的成员之一，已知其调节线粒体中ATP的合成和代谢(Pancrazi等人，2015年). Foxg1对于内耳的正常发育和形成是必不可少的。在…里Foxg1-据报告，裸鼠存在严重的内耳畸形，包括耳蜗缩短，有多排HCs和支持细胞，嵴减少甚至缺失(Pauley等人，2006年; Hwang等人，2009年).机械地，删除Foxg1导致Notch、Wnt、IGF和EGF信号通路的抑制，HCs的产生，以及它们随后凋亡的诱导(何等，2019).此外，Foxg1通过调节自噬来调节听觉退化。在……里Foxg1下调组，自噬途径被显著抑制，活性氧水平显著升高，最终导致肝细胞凋亡(何等，2021).同样的，Foxg1下调还显著增加了HCs对脂多糖诱导的炎症的敏感性，并加速了炎症条件下HCs的凋亡(何等，2020).

3.基因治疗促进肝细胞再生

3.1.HCs再生的基因治疗靶点

由于单个基因在人胚胎干细胞分化和发育中的关键作用，在相关基因缺失后，人胚胎干细胞分化过程中出现发育障碍。因此，通过重新编程内耳SCs中的HC相关基因来诱导再分化以产生新的HC是改善HC相关听力损伤的潜在方法(科斯塔等人，2015年; 倪等，2016; 柴田等人，2020年).HCs再生主要通过两条途径:一是激活非感觉细胞激活重新进入细胞周期，进一步分裂分化为HCs；另一种直接诱导非感觉细胞转分化为HCs而不进行有丝分裂(图3).

3.1.1.HCs增殖再生

细胞周期抑制剂对于有丝分裂后维持细胞处于静止状态至关重要，因此激活非感觉细胞重新进入细胞周期需要相应抑制剂的调节。P27Kip1(第27页)是细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂Cip/Kip家族的成员，在休眠细胞中显著上调(Bencivenga等人，2021年)并且已经显示是内耳中感觉和非感觉细胞的常见细胞周期抑制剂(陈和塞吉尔，1999; 罗文海姆等人，1999年).击倒p27在分离的小鼠耳蜗细胞中，可以有效地激活耳蜗中SCs的增殖以重新进入细胞周期，并且有丝分裂产生的SCs保留了再分化为HCs的能力(罗文海姆等人，1999年; 怀特等人，2006年; Ono等人，2009年; 马斯等人，2013年).进一步的研究表明p27敲除小鼠，不仅仅是SCs打破了细胞周期静止期，HCs也获得了一些增殖能力(沃尔特斯等人，2014年)，并且使用视黄酸抑制也达到了类似的效果p27 (鲁比尼等人，2015年).与p27基因敲除相结合，细胞的转分化Atoh1产生HCs不限于胚胎期，并且能够在成熟小鼠耳蜗中再生HCs(沃尔特斯等人，2017年).不幸的是，通过SCs的有丝分裂再分化产生的HCs在哺乳动物中不能正常发挥作用p27仍然是耳蜗HCs再生的潜在目标。

3.1.2.HCs转分化再生

Atoh1是第一个被鉴定的HC发育相关转录因子，在HC再生中起着不可替代的作用。在…里离体在正常大鼠和豚鼠中的实验，Atoh1过度表达使得耳蜗的非感觉细胞获得产生新的HCs的能力(Kawamoto等人，2003年; 寿等人，2003年).在由耳毒性药物诱导的HC死亡产生的耳聋的豚鼠模型中，Atoh1通过腺病毒载体注射到耳聋动物的耳蜗中，以增加其在非感觉细胞中的表达，这表明在耳蜗损伤的原始部位产生了新的HC。根据听觉脑干反应(ABR)阈值测定，耳聋动物的听力在一定程度上得到恢复(Izumikawa等人，2005年).结果表明，新的HC在耳蜗损伤的原始部位产生，并且使用ABR阈值测量，耳聋动物具有一些听力恢复。

相反，在氨基糖苷类药物诱导的深度耳聋模型中，尽管Atoh1基因治疗诱导耳蜗中的非感觉细胞转化为HCs，产生的HCs未能完全成熟，并且没有改善接受治疗的动物的听力(阿特金森等人，2014年).这一发现表明，需要结合基因疗法来最大限度地提高患者的听力。在培养的小鼠胚胎干细胞中在试管内各种转录因子(Six1, Atoh1, Pou4f3，以及Gfi1)重编程小鼠胚胎成纤维细胞并表达相应的HC标记。所诱导的所得HCs在形态学和生理学上与原发性HCs的情况相似，并且对耳毒性药物敏感(科斯塔等人，2015年; 梅嫩德斯等人，2020年).同样，过度表达Gfi1, Pou4f3，以及Atoh1在人类成纤维细胞中，导致细胞表达一些HCs标记物(杜兰·阿隆索等人，2018年).在药物处理的小鼠耳蜗感觉上皮细胞中，由HC死亡引起的损伤可以通过共转染逆转Pax2和Atoh1，与Pax2促进在册种姓的扩散Atoh1促进HCs的再生(陈等，2013).此外，在与共转染后，HC样细胞的生成效率提高了4.1倍Atoh1和Gfi1与...相比Atoh1独自一人(李等人，2020年); Atoh1和Ikzf2在成年小鼠耳蜗中过量表达诱导SCs转化为耳蜗外HCs(孙等，2021).的表情Atoh1, Gfi1，以及Pou4f3增加老年动物中HC转化的效力(Iyer等人，2022年).

Wnt和Notch通路在细胞增殖和分化中起重要作用，包括调节耳蜗中的HC分化(倪等，2016; Waqas等人，2016年; 吴等，2016; Samarajeewa等人，2019年).扰乱Rbpsuh新生小鼠中的基因或用γ-分泌酶抑制剂处理小鼠内耳细胞导致Notch/RBP-J通路信号的抑制，这反过来导致Hes5的表达和上调Atoh1表达，最终产生异位HCs(Yamamoto等人，2006年; Mizutari等人，2013年; 任等，2016; 罗等，2017).利用siRNA下调Hes1/Hes5也能实现Atoh1上调和增加通过SCs转化HCs的效率(杜等人，2013年; Jung等人，2013年).腺病毒携带人真菌学和贷方（即credit）将重组酶基因注射到成年小鼠的耳蜗中，观察到HC数量的增加以及Notch途径的抑制(舒等，2019).高甲基化1的表达模式(HIC1)转录阻遏物和Prox1基因不会与Atoh1和相关的下游基因，研究证实这两种基因都有抑制作用Atoh1并且导致了Atoh1在出生后的小鼠中表达，而敲除HIC1或者Prox1逆转对…的压制Atoh1表达并最终促进HCs的分化(Kirjavainen等人，2008年; 阿卜杜勒-阿齐兹等人，2021年).同时，增加了Atoch1表达是由Atoch1增强子或小激活RNA来调节HC再生(罗等，2022; 张等，2022).

此外，最近的研究表明Foxg1已经证明了其作为使用基因治疗再生HCs的新靶点的潜力。在老鼠身上Foxg1在内耳SCs中被敲除，与正常小鼠相比，HC数量显著增加，并且存活时间大大增加(张艳等，2020; 张等，2020).

总之，随着对HCs发育分化机制的清楚了解，HCs的再生可以通过干扰相关基因和通路来实现，从而逆转由HCs损伤引起的听力损失。

3.2.CRISPR/Cas9基因编辑系统

作为继锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)之后的第三代基因编辑技术，CRISPR/Cas系统具有靶向明确、RNA序列短、可同时操作多个基因座等优点，其中II型CRISPR/Cas9系统应用最广泛(巴蒂亚等人，2023年; 范德奥斯特和帕蒂尼奥斯，2023年; 王和杜德纳，2023).具有核酸内切酶功能的Cas9蛋白和单引导RNA (sgRNA)剪切靶基因组产生双链断裂(DSB)，进而通过同源定向修复(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)实现靶基因的敲除或敲入(图4).先前的研究已经使用CRISPR/Cas9系统来建立耳聋的转基因小鼠模型，以研究目标基因对于内耳HCs中正常听力的发展和维持的重要性(李等，2018, 2019; 朱等，2018; 崔等，2020; 张等，2020; 涂等，2021; 薛等，2022).CRISPR-Cas9技术现在在临床上阻断耳聋的显性和隐性突变以及改善听力障碍方面也显示出巨大的潜力(捷尔吉等人，2019年; Farooq等人，2020年; 丁等，2021).

贝多芬失聪小鼠是由基因中的一个点突变(T变成A)导致失聪的Tmc1基因座1，235的基因，导致与内耳HCs减少相关的听力损伤，并成功靶向Tmc1通过脂质介导的Cas9-gRNA复合物进入小鼠耳蜗的基因，由于随机插入-缺失导致移位突变和最终功能丧失，这提高了HCs的存活率，同时改善了小鼠的听力(高等，2018).高效击倒Htra2通过将三种gRNAs转染入与细胞凋亡相关基因在试管内耳蜗移植物和在活生物体内scala介质通过CRISPR/Cas9系统改善了由新霉素诱导的毛细胞凋亡引起的听力损失(顾等，2021).此外，CRISPR-Cas9敲除Kcnq4和肌球蛋白VI(MYO6)突变基因已被证明可以拯救遗传性听力损伤(Noh等人，2022年; 薛等，2022).

虽然CRISPR/Cas9系统可以准确高效地编辑目标基因，但它在听力损伤救援研究中也有局限性。在gRNA和靶基因的互补区域附近存在一个短的DNA序列，称为前间隔邻基序(PAM)。PAM序列主要用于识别靶，靶核苷酸中PAM序列的存在与否是CRISPR/Cas9系统精确靶向的关键因素(Manghwar等人，2019年).

3.3.基因递送载体
用于基因治疗的两种主要类型的载体是病毒载体和非病毒载体，即病毒载体，包括腺病毒(AdV)、腺相关病毒(AAV)、慢病毒和逆转录病毒；和非病毒载体，包括电穿孔、脂质体、纳米颗粒和外来体(克林和谢菲尔德，2022年).基因治疗载体的选择非常重要，因为它需要将外源基因安全有效地递送至内耳细胞，而不引起强烈的免疫反应并维持其作用。

AdVs是最先使用的基因递送载体；它们现在用于HC再生的各种领域(Syyam等人，2022年). 在活生物体内或者在试管内涉及将携带不同靶基因的adv注射到靶细胞组织中的实验可以有效地将非感觉细胞转导到HCs中，其中SCs是被转导的主要细胞(Kawamoto等人，2003年; 寿等人，2003年; Izumikawa等人，2005年; Yamamoto等人，2006年; 陈等，2013; 阿特金森等人，2014年; 舒等，2019; 李等人，2020年).然而，adv具有显著的免疫原性作用，并且它们在基因治疗中的作用有限。相比之下，AAV具有低得多的免疫反应性，并逐渐成为不同领域基因治疗的选择载体。AAVs已经证明了其在HCs再生基因治疗中的安全性和有效性。在正常新生和成年小鼠中注射AAV8不会导致内耳中的HCs损伤或听力损失(康等，2020).此外，AAV介导的基因递送在长期药物诱导的耳聋小鼠模型中有效地改善了HCs的凋亡和听力损失(Brigande等人，2009年; 何等，2020; 顾等，2021; 徐等，2021; 薛等，2022).这项研究的结果总结如下。最近的研究表明，have内耳，AAV的一种变体，可以更安全和有效地将Atoh1转导到SCs，并且可能是未来对抗听力损失的基因治疗的最佳载体(谭等，2019; 陶等，2022).此外，慢病毒和逆转录病毒也可用于传递HC再生相关基因；然而，它们的安全性需要改进(科斯塔等人，2015年; 梅嫩德斯等人，2020年).

其他非病毒基因递送方法也已用于再生HCs。Hes1丙烯-羟基乙酸共聚物纳米粒递送的siRNA可降低耳蜗Hes1mRNA上调Atoh1mRNA表达，并在此过程中促进干细胞获得再分化的干细胞(杜等人，2013年).此外，电穿孔对转导编码靶基因的质粒有影响桶和Znf532进入耳朵的上皮祖细胞，激活由基因介导的HCs再生，所述基因例如Atoh1 (Brigande等人，2009年; 徐等，2021).

4.总结和展望
耳蜗中的HCs作为听觉传导系统的关键成员，将传入的机械信号转换为身体感知的电信号。它们在哺乳动物中不能自发再生，导致相关的听力损伤得不到很好的治疗。对人绒毛膜促性腺激素发育成熟机制的探索揭示了人绒毛膜促性腺激素调节基因Atoh1其下游靶向因子激活非感觉性干细胞分化为肝细胞的能力。新兴的基因疗法可以通过载体将外源DNA或RNA导入靶细胞，改变靶细胞的基因表达，改善相关功能。在解决先天性听力障碍后，基于基因的疗法可以在HC再生制的帮助下用于治疗其他类型的听力障碍(表1).

在基于基因治疗的临床环境中诱导HCs再生仍存在许多挑战。首先，人胚胎干细胞的生长和发育受多种基因和途径的调控，单个基因无法使人胚胎干细胞分化为功能齐全的成熟人胚胎干细胞。第二，用于基因递送的载体的选择也是至关重要的，因为有必要将基因有效且准确地递送至靶细胞，而不在体内诱导强烈的免疫反应。最后，在确保高靶向性的同时提高HCs再生的效率需要在基因治疗的多个步骤中进行创新。最近使用CRISPR/Cas9系统结合AAV载体的研究显示了巨大的优势(康等，2020; 赵等，2020).

总之，基于HC再生的基因治疗在治疗感音神经性听力损伤方面显示出巨大的潜力。在进一步研究HC再生机制和优化靶向基因递送方法后，它有望用于临床。