通用现货型T细胞治疗—从iPSC再生T细胞

诱导多能干细胞（iPSC）可以通过重编因子（Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc）重编程，由各种类型的体细胞产生，此技术于2008年获得诺贝尔奖。据报道，iPSCs在许多方面与胚胎干细胞（ESC）非常相似，包括基因表达模式和多能特征。由于iPSCs有着低的HLA表达和不受伦理问题的影响，因此它们为临床中所需的各种类型的细胞或器官的生产，提供了主要细胞来源。

iPSCs的可能应用之一是将它们用作产生T淋巴细胞的细胞来源，用以基于T细胞的癌症治疗，治疗癌症的免疫治疗方法已经有多款药物上市，如嵌合抗原受体（CAR）T细胞免疫疗法，促进了针对多种疾病的T细胞免疫疗法的进一步发展。目前T细胞的来源大多数为外周血单采T细胞，有一种方法是从多能干细胞（PSC）产生T细胞，可以提供产生“现货型”同种异体T细胞的平台。然而，目前的分化方法效率低并且可扩增性差可能会降低其效果和应用。有研究者从T细胞来源的自体抗原特异性CTL细胞克隆并诱导成PSC（iPSC）或提高从T细胞受体（TCR）转导iPSC的分化效率，并搭建了无饲养层(Ff)的分化培养系统，使得T细胞能够大规模扩增。此外，在T细胞分化期间同时添加SDF1α和p38抑制剂增强了T细胞定型，再生的T细胞在体外显示TCR依赖性功能，并且具有体内抗肿瘤活性。该系统提供了一个产生大量的可再生T细胞平台，为临床应用及产业化奠定了基础。

研究者先是利用仙台病毒从CTL克隆中重编产生iPSC，然后从iPSC形成拟胚体（EB），由EB诱导为中胚层并分化产生具有淋巴细胞潜能的为造血母细胞（HPC），再由HPC诱导分化为CD4,CD8 DP T细胞并成熟为CD8单阳的CTL（iCD8ɑβ SP T细胞）

图1

通过拟胚体（EB）形成从iPSCs产生具有淋巴潜力的造血祖细胞，首先使用源自健康人外周血T细胞的iPSC系（TkT3V1-7）进行优化，如图2a所示，将iPSCs培养于层粘连蛋白-511包被的培养器具中解离成单细胞悬液并接种到超低附着板孔板中促进EB形成，使用iPSC增殖培养基并添加GSK-3抑制剂（CHIR99021,CH），在缺氧培养箱中培养24小时。流式细胞时间点分析分化EB的CD34和CD43表达情况，正如预期的那样，分化EB在分化后的前4天上调了CD34的表达，CD43是造血细胞标志，出现在第6 天，之后逐渐增加形成iPSC-HPCs (iHPCs)。

为了研究iHPCs是否能在Ff培养条件下分化为T细胞系，研究者利用固定了Retronectin与DL 4的培养板进行培养，如图2c周期性处理。分化21天后流式检测如图2d，证明能够在Ff培养条件下产生CD7/CD5 + T细胞祖细胞以及更成熟的CD4/CD8ɑβ+DP细胞。

为了提高来源于几种抗原特异性T细胞克隆的iHPCs产生T细胞的稳健性、再现性和产量，测试了已知在胸腺细胞发育中的关键因子。在使用TkT3V1-7系的所有测试因子中，CXCL12（也称为SDF1ɑ）和p38抑制剂（SB203580）协同对提高DP和未成熟单阳性（ISP）细胞的产量和效率有着较高的影响，抑制CD4/CD8双阴性（DN）和CD8SP细胞产生，同时添加两种试剂还抑制了从DN分化为DP时的细胞的凋亡。为了评估每种试剂的效果，对分化细胞流式分析，检测分化过程中不同时间点T细胞分化标志物CD4、CD5、CD7和CD8β以及凋亡相关标志物Annexin V和7-AAD的表达，如图3a，最初的两周内首先是CD7表达，随后上调CD5，最后CD4和CD8β表达，表明这种体外分化培养在表面标记物表达转变方面概括了胸腺细胞发育。细胞凋亡标志物的分析表明，从培养的第2周到第3周，添加两种抑制剂和单独的SB203580抑制了分化细胞的凋亡（图3b）。早在分化后一周，添加两种抑制剂和单独的SB203580也增强了CD7表达（图3c）。此外，只有当两种抑制剂都存在时，DP细胞的频率才会提高（图2c）。当在培养物中同时加入SDF1和SB203580时，细胞产量最高，表明其协同作用（图2d）。利用qPCR对这些因子增强T细胞分化的关键基因表达做了研究，确定SDF1α和SB203580是通过强烈激活T细胞定型基因来增强iHPCs的T细胞分化和细胞产量的因子。无饲养物培养还可以换成无血清培养基培养，在αMEM中添加BSA、胰岛素和转铁蛋白可以使iHPCs可分化为DP细胞。

为了延伸SS这两个因素的效用，并检测T-iPSC来源的iCD8ɑβ SP T细胞的抗原特异性体外功能，使用三个来源于已知抗原特异性CTL克隆诱导的iPSC分化为成熟T细胞。其中两个源自HIV-1的Nef38-8 peptide138-145和Gag28-8 peptide“KYKLKHIVW”（分别为H25-4和H25-31）特异性CTL克隆的T-iPSC克隆和一个glypian-3（GPC3）peptide144-152特异性CTL克隆。由于T-iPSC仍然含有内源性TCR，而TCR重排会导致抗原特异性的丢失，因此使用重组酶激活基因（RAG-2）缺失的GPC3 T-iPSC克隆防止T细胞分化过程中额外的内源性TCR重排，到分化后第18天，三个分化的T-iPSC克隆都有CD34和CD43的表达，与TkT3V1-7克隆一致，三个T-iPSC系中的细胞数量相当的。然而，在用GPC3 T-iPSC培养的第18天，CD34/CD43-HPCs的阳性和产量低于其他两个，因为GPC3 T-iPSC比其他克隆分化得更快。T-iPSC-HPC在SDF1α和SB203580存在下，第21天成功分化为CD7/CD5 T细胞，其中一部分也是CD4/CD8ɑβ DP细胞，也证明了SS对其他iPSC克隆的效用（图4a，b）。还通过DL4诱导细胞成为CD4⁻CD8ɑβ⁺成熟T细胞（图4c）。刺激7天后，DL4诱导细胞完全分化为CD4⁻CD8ɑβ⁺SP T细胞（T-iPSC-iCD8ɑβ T细胞），且大多数iCD8ɑβ T细胞对其特异性四聚体呈阳性（图4d）。H25-4、H25-31和GPC3 T-iPSC从T-iPSC到T-iPSC iCD8ɑβ T细胞的产量估计分别为73275、20107和2384.7（图4e），这些结果证实了从多个T-iPSC系成功产生CD8 SP T细胞。

图4

通过TCR刺激和抗原特异性细胞毒性来探索三种T-iPSC iCD8αβ T细胞的增殖潜力，TCR刺激后，所有T-iPSC iCD8αβ T细胞在刺激后14天增殖至原来400倍。流式结果显示，大多数增殖的是Tetramer CD8αβ双阳细胞，但失去了CD27的表达。为了检测增殖的T-iPSC iCD8αβ T细胞的抗原特异性细胞毒性。H25-4衍生的T-iPSC iCD8αβ T细胞诱导了负载Nef peptide的淋巴母细胞样细胞系（LCL）的凋亡，但没有诱导负载Gag peptide的LCL的凋亡（图4f）。相反，H25-31衍生的T-iPSC iCD8αβT细胞杀死了负载Gag peptide的LCL，而当与负载Nef peptide的LCLs共培养时没有显示出这种活性（图4g）。GPC3衍生的T-iPSC iCD8αβ T细胞诱导外源性表达GPC3的SK-Hep细胞系的凋亡，但对用空载体转导的SK-Hip显示出几乎没有活性（图4h）。这些数据证实了Ff分化培养系统中的CD8αβ⁺ T 细胞的产生和特异性功能，这些细胞可以来自于多个T-iPSC克隆体。

为了研究Ff分化系统是否可以扩展到TCR转导的iPSC系，研究者使用人类白细胞抗原（HLA）纯合供体产生的iPSC克隆，TCR工程化iCD8αβ T细胞的生产方案如图5a所示，简单地说，用慢病毒转导WT1 235–243 peptide特异性HLA-a*24:02 TCR的α和β链至HLA纯合iPSC，并通过FACS纯化转基因阳性细胞，挑选4-2克隆成功分化为HPC，与未转染的亲代HLA同源iPSC系FfI01s04相当（图5b）。此外，4-2克隆的iHPCs在第21天，被有SS和DL4存在的条件下分化为CD4⁺CD8αβ⁺TCRαβ⁺T细胞，而亲代iHPCs分化的细胞在相同的培养条件下产生了TCRγδ⁺T细胞，表明非TCRαβ转导T细胞产生的iPSC促进了TCRγδ⁺T细胞分化（图5c）。1 × 10⁵个iHPC在15 cm DL4包被的培养皿中平均生成 6.2 × 10⁸个T细胞。成熟后，来自DL4的4-2克隆细胞完全分化为CD4⁻CD8αβ⁺CD3⁺WT1 Tet⁺细胞（图5e）。通过对编码TCR Vα和Vβ互补决定区3（CDR3）的序列进行测序确定是来自4-2克隆分化T细胞（图5f）。成熟的WT1-TCR-iCD8αβ T细胞，外源引入的Vβ链几乎是单克隆表达，这些结果证明了从TCRαβ工程化临床级HLA纯合iPSC系大规模产生抗原特异性CD8αβ⁺ Tetramer⁺T细胞。

针对TCR激活和细胞因子信号传导，对于第一信号优化，将OKT3抗体在不同浓度的Retronectin存在下包被在孔中，并在刺激3天后检测ATP浓度，筛选确定了OKT3和Retronectin的最佳浓度为3.0和150 μg/ml。对于第三个信号优化，单独IL-7、12、15、18、21和TL-1A的组合也在Ff条件下增强了TCR工程化的iCD8αβ T细胞的激活。

在这些条件下，分化的CD8αβ⁺Tetramer ⁺细胞可以被反复激活和增殖，而不会失去CD8α和CD8β的表达。为了适应临床要求，需采用无血清培养，筛选出了ImmunoCult XF T细胞扩增培养基和CTS OpTmizer培养基可以在14天内分别诱导TCR工程化的iCD8αβ T细胞增殖60倍和30倍，流式分析表明，在无血清培养基中增殖的细胞表达的表面标记物与传统的含FBS的培养基相似。

流式细胞术分析显示，增殖的iCD8αβ T细胞表达CD45RO，但CCR7未表达。WT1- iCD8αβ T细胞在体外杀死了靶细胞（表达WT1 的癌细胞系NCI-H226），图8c。细胞因子释放的流式数据显示，在靶细胞刺激下，iCD8αβ T细胞产生IFN-γ，TNF和IL-2（图8d）。在荷瘤模型中，通过Ff培养法增殖的WT1-TCR iCD8αβ T细胞也能够控制疾病进展，并在接种间皮瘤细胞系NCI-H226的异种移植模型中显示出生存获益（图8e，f），这些结果表明，TCR工程化iCD8αβ T细胞的大规模生产能够在体外和体内显现出抗肿瘤活性，也不会在Ff条件下失去CD8αβ共受体表达。

图8

利用先前WT1- iCD8αβ T，通过逆转录病毒转导构建了表达CD19 scFv-4-1BB-CD3ζ  CAR的iT细胞（iCART细胞），参考嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法评估iCART的体外和体内功能。还用膜结合的IL-15转导iCART细胞（图9a，b）。iCART细胞低表达CD45RA和CCR7，但高表达CD45RO和CD62L，类似于亲代iT细胞，iCART细胞不表达耗竭标志物PD1和TIM3，但表达LAG3（图9c）。iCART细胞具有CD19依赖性细胞毒性，杀死CD19 NALM-6，但不杀伤CD19 CCRF-CEM癌症细胞系（图9d）。为了评估iCART细胞的CD19依赖性细胞分裂，利用CFSE染色，在没有细胞因子的情况下将iCART细胞与NALM-6或CCRF-CEM共培养6天，并测量它们的细胞分裂，发现iCART细胞与NALM-6共培养时分裂，但与CCRF-CCM共培养时不分裂（图9e），显示出CD19依赖性细胞因子的产生，包括IL-2、IFN-γ、TNF和GM-CSF（图10a）。

最后，在NALM-6荷瘤的小鼠模型中评估了iCART细胞的体内抗肿瘤作用，在NALM-6接种后4天，将iT细胞和iCART细胞静脉注射到荷瘤小鼠中，为了比较iCART细胞与原代CART细胞的治疗效果，还构建了表达CD19特异性CAR（CART）的原代T细胞，并将其注射到NALM-6荷瘤小鼠中（补充图10a）。在PBS对照和iT细胞小鼠体内中，肿瘤细胞迅速扩散到全身，并且在细胞注射后3周体重显著减轻而死亡或被安乐死。与对照组和iT细胞小鼠相比，iCART细胞小鼠出现延迟复发和相对高的总生存率（图9f，g）。iT细胞和iCART细胞小鼠骨髓细胞的流式结果显示，在iCART细胞小鼠治疗后的第10天和第15天，GFP/CD19 NALM-6细胞几乎完全消除，且存在iCART细胞（图9h）。值得注意的是，五分之二的iCART细胞小鼠在治疗后至少128天无复发存活。对这些无复发小鼠的分析显示，iCART细胞存在于骨髓中，但不存在于血细胞中（图10b）。与对照组相比，pCART细胞的小鼠也出现延长的生存期，尽管IVIS测量，iCART细胞的小鼠死于肿瘤复发，但pCART细胞治疗组中的一些小鼠开始便死亡，并伴有严重的体重减轻，而没有肿瘤复发的证据，需要安乐死。这些死亡很可能是由异种移植物对抗宿主疾病（GvHD）引起的。这些结果表明，iCART细胞能够移植，并具有抗肿瘤活性，在肿瘤清除后持续存在。

   这项研究提供了用于临床阶段的Ff培养条件下，从iPSC产生功能性CD8αβT细胞，高效且可扩增的方法。生产iPSC-T细胞库作为“现货型”的T细胞来源，这些iPSC-T细胞源将用作下游修饰的起始细胞，如CAR转导，TCR工程化构建。与生理性T细胞免疫疗法的制造过程相比，iPSC-T细胞库方法不涉及T淋巴细胞单采。目前为止，已经可以生产1L约2 × 1010个的iT细胞培养，这个数字足以进行安全性评估的初步临床试验。当整合其他技术，如用于T细胞排异的HLA编辑、用于降低GvHD风险的TCR敲除和用于NK细胞排异逃脱的基因转导，iPSC-T细胞将成为T细胞免疫疗法的理想通用细胞源。总之，这项研究证明了一种高效且可扩展的平台，用于从iPSC中产生功能性CD8αβT细胞，可用于生产“现货型”T细胞治疗产品，用于同种异体T细胞免疫治疗。

参考资料