PNAS | 双重CRISPR消除体内HIV

     目前的HIV-1治疗包括抗逆转录病毒疗法（ART）和广泛中和抗体，两者都可以减少病毒复制，但不能做到消除病毒。HIV-1在CD4+T细胞和单核吞噬细胞（Mono、Mac和DC）中的潜伏期，是治愈的主要屏障。

    有研究者用卡博替拉韦、拉米夫定和阿巴卡韦的长效药与天然利匹韦林联合治疗HIV-1（ADA毒株）感染的CD34+NSG人源化小鼠，然后进行双CRISPR-Cas9，靶向敲除CCR5（CCR5是HIV-1的主要受体）和HIV-1前病毒DNA基因，持续抑制病毒复制，然后在58%的受感染小鼠中消除了具有复制能力的病毒。

双重CRISPR疗法能够敲除受感染动物体内细胞中整合的前病毒DNA，利用高灵敏度数字PCR、RNAscope和病毒生长测定证实了病毒的消除，并在此后的动物血液、脾脏、肺、肾脏、肝脏、肠道、骨髓和大脑中未检测到HIV-1，值得注意的是，CRISPR敲除后移植到无病毒小鼠中没有检测到子代病毒。与单一敲除治疗相比，双重CRISPR敲除在HIV-1治愈率方面具有统计学的显著改善。总之，这些结果强调了组合CRISPR基因编辑在消除HIV-1感染中的关键作用。

研究人员设计gRNA靶向CCR5 delta32缺失区域，以避免脱靶效应。使用TZM-bl细胞评估了其敲除CCR5 DNA序列的能力（图1A），通过PCR证实了CRISPR-Cas9的基因编辑，并通过Sanger测序验证了所得截短的（484bp）扩增子（图1B，D）。敲除后的细胞与对照组相比，缺乏CCR5表达（图1C），并免受CCR5嗜性HIV-1BAL-GFP的感染，在T淋巴细胞系HuTR5中也观察到相似的结果。此后对未感染的人源化小鼠的人类免疫细胞中的CCR5敲除后表达研究，小鼠在20周龄时注射由腺病毒AAV6递送的靶向CCR5的CRISPR-Cas9。在第1、3、5、7天收集外周血，并通过流式细胞术检测CCR5的表达，结果表明，CD45+CD3+CD4+T细胞中CCR5表达水平下降（图1F）。通过PCR和基因组测序证实了CRISPR诱导的截短DNA的存在（图1 G和H）。这些数据支持CRISPR-Cas9 CCR5靶向敲除可以减少HIV-1 LTR-Gag介导的病毒传播。

在HIV-ADA感染后，用主流抗HIV药物卡博替拉韦（CAB）、拉米夫定（3TC）、阿巴卡韦（ABC）和天然利匹韦林（RPV）进行抗逆转录病毒治疗，以抑制病毒复制，然后给予AAV6/CRISP-Cas9，敲除CCR5减缓病毒传播，最后通过AAV9/CRISPR-Cas9靶向敲除前病毒DNA片段，方案如图2A。结果表明在所有ART治疗的小鼠中观察到CD4+T细胞数量的恢复，在没有ART的情况下的CD4+T细胞水平较低，但高于对照组，与ART和单独HIV LTR-Gag或CCR5敲除治疗相比，给予双重CRISPR敲除和ART治疗的HIV-1感染小鼠的病毒载量（Viral load）降低（图2B，C）

图2  LASER ART和CRISPR-Cas9联合治疗HIV-1感染的人源化小鼠

为了证实这些结果，设计靶向HIV-1的探针，通过原位杂交RNAscope技术在5μm厚的脾脏切片中检测HIV-1 RNA。在上述实验条件下，双CRISPR组中的10只小鼠中的6只没有检测到HIV-1 RNA（图3A）。并利用微滴式数字PCR（ddPCR）检测了6只小鼠中不存在HIV-1 DNA（图3B），验证了先前的结果。研究者又将双CRISPR与单独治疗组的骨髓细胞和脾细胞移植到未感染的人源化小鼠中来观察病毒生长测定（VOA），在移植后小鼠血浆中没有观察到病毒复制（图3D）。设计特异性引物对PCR扩增的DNA片段进行凝胶电泳分析，结果显示用LASER ART和双CRISPR-Cas9处理的小鼠中，脾脏提取的病毒DNA片段有效敲除（图3C，底部两张图）。这些研究结果显示，ART和双CRISPR治疗组的HIV消除率超过50%。

图3 LASER ART和CRISPR-Cas9联合治疗HIV-1感染的人源化小鼠病毒消除

为了确定这些结果的有效性，按照图2A所示的类似方案，用另一组独立的人源化小鼠进行了重复实验。在本实验中，用2×10⁴的HIV-1ADA感染9只人源化小鼠2周，再给予LASER ART 4周，以最大限度地降低病毒复制的传播水平。然后用靶向CCR5的CRISPR-Cas9（第7周）和LTR-gag（第8周）治疗小鼠，并在病毒感染后17周评估病毒复制。在研究结束时，发现9只小鼠中有6只血浆中检测不到病毒（图4B）。CD3+CD4+T细胞在多数小鼠中恢复（图4A）。通过qPCR从组织中扩增病毒DNA和RNA（图4D）、RNAscope（图4C）和ddPCR（图4E）鉴定了5/9只动物（编号706、709、622、651和674），未检测到HIV-1。

图4  验证HIV-1感染和治疗的人源化小鼠的病毒和免疫谱

这些研究显示，ART、ART和CRISPR CCR5或HIV-1 LTR-Gag的比较显示，在病毒消除方面没有显著差异。然而，在CRISPR CCR5和HIV-1 LTR-Gag联合ART治疗中，病毒消除显著增加，在受感染的小鼠中产生了58%的HIV-1总消除率。

通过靶向宿主CCR5和HIV-1 LTR-Gag进行CRISPR基因编辑，同时通过抗逆转录病毒药物控制病毒复制，可以在受感染的组织中消除HIV-1，ART停药后11周没有出现病毒反弹。在人源化小鼠中，用于病毒基因组和特定细胞基因（如CCR5）组合编辑的LASER ART可能会实现较好的治疗效果并作为临床试验进一步研究。类似的双靶点策略在双抗与双靶点CAR-T中也有研究，并取得了符合预期的临床效果。此项研究使用的递送载体为AAV，而现阶段药物递送系统发展迅猛，出现了一些如聚合物脂质，脂质纳米颗粒（LNP），病毒样颗粒（VLPs），外泌体/细胞外囊泡（EVs）等一些优选的递送系统，或可进一步提高此类研究的治疗效果。总之，两种CRISPR介导的消除病毒策略与ART的联合用药实现了有效的HIV-1消除，并有可能转化为临床。

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