MED 科研动态 | 杜洋教授团队在Nature Communications揭示人体孤儿受体GPR88激活和别构调节机制

G蛋白偶联受体（G-protein coupled receptor，GPCR）是人类基因组中最大的膜信号蛋白家族，包含800多个成员[1]。然而其中大约140个受体的内源性配体仍然未被确定[2,3]。这些孤儿受体（orphan GPCR，oGPCR）的配体结合和信号传导机理尚不明确，例如自激活机制。因此，为oGPCR“脱孤”以及解析它们的结构能够帮助研究者进一步了解GPCR的分子机理，为相关疾病的药物开发带来新的思路。

GPR88隶属于A类GPCR，在大脑（特别是纹状体）中特异性表达[2,3,5]。该受体能够调节GABA和谷氨酸信号通路，以及包括多巴胺受体和阿片类受体等一些其他的GPCR活性[6,7]。转录分析和小鼠敲除研究表明，GPR88在调节大脑和行为功能（例如认知，情绪，基于奖励的学习和运动控制）中起着重要作用[6, 8, 9]。因此，GPR88是治疗中枢神经系统相关疾病（包括精神分裂症，帕金森氏病，躁郁症，焦虑，抑郁症和成瘾）的潜在药物靶标[2, 3, 10]。

近日，香港中文大学（深圳）医学院、科比尔卡创新药物开发研究院杜洋教授、柳正教授团队联合埃尔朗根-纽伦堡大学Peter Gmeiner教授团队和日本东北大学Asuka Inoue教授团队在国际一流科学期刊Nature Communication杂志发表了题为“Activation and allosteric regulation of the orphan GPR88-Gi1 signaling complex”的最新研究成果。该研究基于冷冻电镜技术解析了人类GPR88-Gi1和合成激动剂(1R，2R)-2-PCCA信号复合物的结构，表明了(1R，2R)-2-PCCA结合在由跨膜螺旋5、6的细胞质末端和Gi1的α5螺旋C末端组成的变构位点，展示了正构结合位点的电子密度代表未知的内源性配体。MD和突变研究揭示了一组独特的结构特征和水介导的极性网络的GPR88的独特激活机制，为理解GPR88的配体结合、激活和信号传导机制提供了一个结构框架，并将促进神经精神疾病的创新药物发现以及该受体的“脱孤”。香港中文大学（深圳）为第一作者单位，杜洋教授为该研究最后通讯作者。陈耕博士、徐俊博士、Maximilian Schmidt和Asuka Inoue并列第一作者。

在结合或不结合2-PCCA的情况下，研究者将GPR88-Gi1复合物与scFv16（用于稳定Gi的抗体）组装在一起，获得了两个复合物在2.4 Å和3.0 Å分辨率下的cryo-EM密度图，并藉此重建了原子结构模型（图1）。受体的N端，C端，细胞内环3（ICL3），细胞外环1（ECL1）和细胞外环2（ECL2）的电子密度有所缺失，表明这些区域较为灵活和无序。与近期解析的GPR52不同，GPR88的ECL2没有良好折叠并扮演自激活的激动剂[4]，正构位点未确认的密度表明其可能拥有独特的自激活机制。2-PCCA则结合在变构位点，其周边推测存在三个胆固醇分子。

图1 GPR88-Gi1冷冻电镜结构

（图源：Chen G, et al., Nat Commun, 2022）

GPR88的正构位点由TM3、TM4、TM5、TM7和ECL2的一部分组成，在A类GPCR中较为保守。对该口袋的表面静电势分析表明，TM3、TM4和TM5产生了一个长的疏水孔，同时细胞外表面带电并且亲水（图2）。结合两极化的口袋特征和位于口袋中电子密度的形状，作者推测该电子密度代表了一种脂质分子，扮演内源性配体的角色。该脂质分子非极性尾部插入疏水孔中，极性头部则位于口袋的细胞外侧。

图2 GPR88的变构结合口袋

（图源：Chen G, et al., Nat Commun, 2022）

GPR88的变构位点由TM5、TM6的细胞质末端和Gi1的α5螺旋C末端组成，该变构位点未在其他GPCR结构中报导过。结合在该口袋的2-PCCA的中心酰胺有三个取代基，分别为氨烷基（aminoalkyl，R1），吡啶基环丙基（pyridylcyclopropyl，R2）和联芳基（biaryl，R3）。其中R2插入了口袋，芳环中的邻位氮与甘氨酸的主链 NH 形成氢键；R1、R3和TM5、TM6面向膜的表面疏水氨基酸（包括缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸和半胱氨酸）形成了广泛的疏水相互作用。研究者还观察到三个假定的胆固醇分子和TM5、TM6一起形成了和正构位点相似的疏水孔，进一步增强了2-PCCA在变构位点的结合。构效关系分析结果证明：配体R2基团的吡啶和变构口袋表面亮氨酸、缬氨酸（疏水氨基酸）对2-PCCA结合变构位点并激活受体非常重要。

GPR88的活性构象和视紫红质（rhodopsin）等其他A类GPCR有所不同。首先，GPR88较短的跨膜螺旋、更靠内的TM6，使得TM5和TM6细胞质末端界面形成空腔，即变构位点。其次，序列对比表明GPR88的ECL上缺少半胱氨酸，进而缺少二硫键的形成，导致GPR88的ECL更加动态。另外，GPR88缺少A类GPCR保守的拨动开关W6.48和P5.50-I/L3.40-F6.44基序。拨动开关W6.48在其他视紫红质家族的GPCR激活中触发TM6向外移动，GPR88中该位点则被苏氨酸代替。P-I/L-F基序的空间重排在从细胞外域到G蛋白耦合界面构象变化的传播中起关键作用，然而在GPR88中，P5.50被Q2045.50所取代并和L1283.40、F6.44相互作用（即Q-L-F基序）；同时，L1283.40位于未确认的电子密度下方并可能和假定的内源性配体有直接接触。将Q2045.50突变为脯氨酸（P）增强了2-PCCA对GPR88的活性，证明在信号传导上，更典型的P-L-F基序比GPR88的Q-L-F基序可能更加有效（图3）。

图3 序列比对，Q2045.50和H1313.43的突变实验

（图源：Chen G, et al., Nat Commun, 2022）

TM7中的N7.49P7.50xxY7.53基序是另一个在A类GPCR中保守的序列。在活性视紫红质和μ阿片受体（μOR）中，Y7.53和N7.49和TM3及TM5通过水形成极性网络相互作用，其中的氢键涉及骨架羰基[11, 12]。在GPR88中，亲水氨基酸组氨酸（H1313.43）直接和Y3367.53形成氢键。值得注意的是，研究者观察到位于Y3367.53和H1313.43界面上两个水分子的电子密度（图4）。上方的水分子进一步增强了N7.49P7.50xxY7.53基序和TM3之间的极性相互作用；下方的水分子则介导了与视紫红质和μ阿片受体中相似的，Y3367.53、H1313.43和Y2125.58之间的氢键网络。

图4 水介导的极性网络

（图源：Chen G, et al., Nat Commun, 2022）

研究者此后又进行了从活性状态到非活性状态（通过删除2-PCCA、Gi1和scFv16）的元动力学模拟（metadynamics simulations），结果和观察到的结构特征相符：拨动开关T6.48的2.2 Å位移；Q5.50-L3.40-F6.44基序的大型结构重排；水介导的氢键网络进行了重新排列：H1313.43下方的水分子从受体核心移位，导致N7.49P7.50xxY7.53的构象变化；上方的水分子仍然存在，介导TM3和TM7之间的一个小极性网络。值得注意的是，H1313.43在未被激活时也参与了该极性网络，表明了其在稳定GPR88的非活性构象中的潜在作用。值得注意的是，受体失活重塑了变构位点。结果是在模拟中，TM6的向内运动缩小了变构位点的疏水袋，阻止了2-PCCA的结合（图5）。

图5非活性状态GPR88的元动力学模拟

（图源：Chen G, et al., Nat Commun, 2022）

结合或不结合2-PCCA的结构在G蛋白耦合界面几乎相同，在2-PCCA结合结构中G蛋白的略微向上移动。与先前报道的复合物结构相似，α5螺旋的C末端插入由TM3和TM5-7的细胞质末端形成的空腔中。该空腔中，α5螺旋和TM3、TM5和TM6上的疏水氨基酸通过疏水接触相互作用，同时α5螺旋半胱氨酸的骨架羰基和TM3的精氨酸之间形成了氢键。值得注意的是，变构2-PCCA还通过与GPR88的TM5-TM6、Gi1的α5螺旋参与疏水网络，进一步稳定GPR88-Gi1信号传导复合物的界面并且导致Gi1的轻微移动。

除了疏水接触外，TM5的细胞质末端和α5螺旋的底部之间存在极性相互作用， GPR88的ICL2和Gi1的αN螺旋之间也存在一个极性界面，主要涉及氢键的形成。这些极性相互作用对于GPR88和Gi1之间的耦合可能至关重要（图6）。

图6 GPR88和Gi1的耦合界面

（图源：Chen G, et al., Nat Commun, 2022）

综上所述，该研究展示了结合或不结合合成激动剂（2-PCCA）的GPR88-Gi1信号传导复合物结构。这些结构在GPR88的规范正构袋中揭示了相似的电子密度，该密度可能代表受体的假定内源配体。2-PCCA是一种变构激动剂，与变构位点结合，直接涉及与G蛋白的相互作用，进一步稳定了信号传导复合物，从而促进了GPCR88的高活性。Apo-GPR88-Gi和2-PCCA-GPR88-Gi的高分辨率结构对比表明，正构袋中的假定内源配体可以与GPR88共纯化。此外，未确定的密度和正位口袋的特性表明GPR88可能是响应某些生物活性脂质的受体。令人感兴趣的是，与其内源性激动剂S1P结合的鞘氨醇1-磷酸（S1P）受体的最新结构显示出与GPR88相似的正位结合口袋，口袋中形成了用于结合S1P的穿透性长隧道[13]。因此研究者推测，GPR88的内源性激动剂可能是一种与S1P相似的脂质分子，并且该脂质配体可能能够与GPR88的变构位点结合以调节信号传导。但是，作者不能排除脂质分子具有分支结构和未确定的电子密度由灵活区形成的可能性。

该研究还揭示了一个广泛的由水介导的氢键网络，该网络连接了受体细胞外结构域和G蛋白，稳定GPR88的活性构象。GPR88跨膜核心区的不保守残基H1313.43不仅在介导极网络中扮演着关键作用，而且还是维持GPR88的功能表达的关键，这揭示此孤儿受体中独特的结构特征。通过比较活性cryo-EM结构与元动力学生成的GPR88的去活化模型，该研究揭示了与GPR88激活相关的关键构象变化。

总而言之，该研究提供了理解孤儿受体GPR88的配体结合，激活和信号转导的结构基础。这些发现将促进GPR88的“脱孤”。基于结构的激动剂、拮抗剂设计可能会为中枢神经系统疾病提供有价值的候选药物。

第一作者简介

陈耕 博士

香港中文大学（深圳）医学院/科比尔卡创新药物开发研究院助理研究员，鹏程孔雀计划特聘岗位。博士毕业于Baylor University，并在UT Austin从事博士后研究工作，现从事GPCR药物靶点的结构研究和药物开发。

杜洋 教授

医学院助理院长（科研与创新）

香港中文大学（深圳）医学院助理院长（科研与创新）、科比尔卡创新药物开发研究院研究员，博士生导师，教育部青年长江学者，广东省珠江青年拔尖人才。师从诺贝尔化学奖得主Brian Kobilka教授从事GPCR相关的博士后研究工作，回国前获得密歇根大学安娜堡医学院tenure-track助理教授职位等。迄今已发表约60篇高质量SCI论文，包括以第一或通讯作者（含共同）在Cell、Sci. Adv.、JACS、Nature Comm.、Cell Res.等国际一流期刊报道的科研和转化成果。拟招聘博士后和学术型硕士/博士生，欢迎感兴趣的同仁联系交流

（yangdu@cuhk.edu.cn）。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41467-022-30081-5

参考文献

[1] Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schioth, H. B. & Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nat. Rev. Drug Disco. 16, 829–842 (2017).

[2] Ye, N. et al. Orphan receptor GPR88 as an emerging neurotherapeutic target. Acs Chem. Neurosci. 10, 190–200 (2019).

[3] Watkins, L. R. & Orlandi, C. Orphan G protein coupled receptors in affective disorders. Genes 11, https://doi.org/10.3390/genes11060694 (2020).

[4] Lin, X. et al. Structural basis of ligand recognition and self-activation of orphan GPR52. Nature 579, 152–157 (2020).

[5] Mizushima, K. et al. A novel G-protein-coupled receptor gene expressed in striatum. Genomics 69, 314–321 (2000).

[6] Massart, R., Guilloux, J. P., Mignon, V., Sokoloff, P. & Diaz, J. Striatal GPR88 expression is confined to the whole projection neuron population and is regulated by dopaminergic and glutamatergic afferents. Eur. J. Neurosci. 30, 397–414 (2009).

[7] Laboute, T. et al. The orphan receptor GPR88 blunts the signaling of opioid receptors and multiple striatal GPCRs. eLife 9, https://doi.org/10.7554/eLife.50519 (2020).

[8] Meirsman, A. C. et al. Mice lacking GPR88 show motor deficit, improved spatial learning, and low anxiety reversed by delta opioid antagonist. Biol. Psychiatry 79, 917–927 (2016).

[9] Quintana, A. et al. Lack of GPR88 enhances medium spiny neuron activity and alters motor- and cue-dependent behaviors. Nat. Neurosci. 15, 1547–1555 (2012).

[10] Bi, Y. et al. The discovery of potent agonists for GPR88, an orphan GPCR, for the potential treatment of CNS disorders. Bioorg. Med. Chem. Lett. 25, 1443–1447 (2015).

[11] Huang, W. J. et al. Structural insights into mu-opioid receptor activation. Nature 524, 315–31 (2015).

[12] Standfuss, J. et al. The structural basis of agonist-induced activation in constitutively active rhodopsin. Nature 471, 656–660 (2011).

[13] Maeda, S. et al. Endogenous agonist-bound S1PR3 structure reveals determinants of G protein-subtype bias. Sci. Adv. 7, https://doi.org/10.1126/sciadv.abf5325 (2021).

文字：张炳皓

供图：杜洋教授团队

编辑出品：医学院传讯公关办公室

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