浙江大学孙红祥教授团队：合欢皮皂苷活性部位诱导C2C12成肌细胞先天性免疫反应的机制 | MDPI Vaccines

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研究背景和研究内容

合欢皮皂苷活性部位 (AJSAF) 能增强抗原特异性体液免疫和细胞免疫应答，可同时诱导 Th1/Th2 和 Tc1/Tc2 免疫应答，是一种理想的疫苗候选佐剂。前期研究发现，AJSAF 的佐剂活性依赖于与抗原的共定位，说明局部先天免疫在其机制中的作用。然而，其潜在的靶标和信号通路尚不明确。

来自浙江大学动物科学学院的孙红祥教授及其团队在 Vaccines 期刊发表了文章。本研究分别以小鼠成肌 C2C12 细胞与小鼠股四头肌作为体外和体内模型，通过体内外转录组学整合分析，并结合实验验证，探究 AJSAF 诱导先天性免疫反应的分子机制。AJSAF 对 C2C12 细胞呈现瞬时的细胞毒性并诱导短暂的炎性反应。GSEA 分析揭示，AJSAF 通过第二信使–MAPK–CREB 通路调控细胞死亡和炎相关基因的表达。AJSAF 显著提高 C2C12 细胞 Ca²⁺、cAMP 和活性氧的水平，促进 MAPK 和 CREB 磷酸化。Ca²⁺ 螯合剂、CREB 和 MAPK 特异性抑制剂显著拮抗 AJSAF 诱导 C2C12 细胞炎性因子基因和蛋白的表达上调。这些结果表明：AJSAF 通过 Ca²⁺–MAPK–CREB 通路诱导先天性免疫反应。本研究拓展了对皂苷佐剂分子机制的认识。

研究结果

1. AJSAF 对 C2C12 细胞呈现瞬时的细胞毒性并诱导短暂的炎性反应

AJSAF 作用4 h，浓度200−300 μg/mL处理的 C2C12 细胞呈现显著的毒性反应 (IC₅₀=210 μg/mL)。然而，AJSAF 处理24 h，除300 μg/mL 外，其他浓度对 C2C12 细胞增殖无显著影响 (图1A)。RT-qPCR 结果显示：AJSAF 显著上调炎性因子 IL-6、CXCL1 和 COX2 mRNA水平，4−6 h到达峰值之后迅速下降 (图1B–E)。同时，AJSAF 能显著诱导上述炎症因子分泌和蛋白表达，并呈现浓度依赖性。这些结果表明：AJSAF 对 C2C12 细胞呈现瞬时的细胞毒性，并诱导 C2C12 细胞短暂的炎性反应。

图1. AJSAF 对 C2C12 细胞呈现瞬时的细胞毒性并诱导短暂的炎性反应。

2. AJSAF 诱导 C2C12 细胞差异表达基因 (DEGs) 的功能及通路

研究采用小鼠基因表达谱芯片检测 AJSAF 处理 C2C12 细胞转录谱变化，生物信息学分析流程见图2。AJSAF 显著诱导 C2C12 细胞738个基因上调和700个基因下调 (图3A)。GO 功能和 KEGG 通路富集分析结果表明：这些 DEGs 生物学功能主要涉及“细胞迁移”“MAPK 级联反应”“ERK1 和ERK2 级联反应”“细胞趋化”等；KEGG 通路主要富集于“PI3K-Akt 信号”“MAPK 信号”“cAMP 信号”及“钙离子信号”等 (图3C)；参与细胞增殖、细胞死亡、细胞分化、细胞迁移、以及对损伤和外部刺激的反应 (图3D)。

图2. 转录组学分析流程。

图3. AJSAF 诱导 C2C12 细胞 DEGs 的功能和通路。

3. AJSAF 诱导 C2C12 细胞核心基因的功能

通过 GSEA 分析，获得 AJSAF 诱导 C2C12 细胞8个关键基因集 (LEGSs)(图4A)，并筛选得到117个核心基因 (图4B)。这些核心基因参与“细胞趋化”“炎症反应”“细胞死亡”“细胞迁移”等生物学功能；涉及“TNF 信号”“PI3K−Akt 信号”“MAPK 信号”和“cAMP 信号”等通路 (图4C)。运用 Cytoscape 软件 MCODE 插件得到3个关键模块 (图4D、E)。

图4. AJSAF 诱导 C2C12 细胞核心基因的功能。

4. AJSAF 肌注诱导小鼠股四头肌组织核心基因的功能

同样采用 GSEA 分析获得 AJSAF 肌注诱导的小鼠四头肌组织全基因谱8个 LEGSs (图5A)，并筛选出111个核心基因 (图5B)。这些核心基因参与“细胞趋化”“炎症反应”“细胞死亡”“细胞迁移”等生物学功能，涉及“TNF 信号”“PI3K−Akt 信号”“MAPK 信号”和“cAMP 信号”等通路 (图5C)。同时，鉴定出4个关键模块 (图 5D−E)。

图5. AJSAF 肌注诱导小鼠股四头肌组织核心基因的功能。

5. AJSAF 诱导的体内外共同核心基因的功能及 Hub 基因

体内外核心基因共同富集到的 TOP20 GO 和 KEGG 条目主要与细胞活化、细胞死亡、粒细胞趋化、炎症反应、MAPK 级联反应及第二信使介导的信号通路有关 (图 6A、B)。TRRUST 数据库分析表明：体内外核心基因共有的上游转录因子17个 (图 6C)。Circos 图显示：体内外核心基因存在32个共有基因 (图6D)，参与炎症反应、细胞趋化等 AJSAF 核心功能 (图6E)。通过 UpSet 分析进一步获得6个 Hub 基因，即 Il6、Csf2、Cxcl1、Il1b、Ptgs2 (Cox2) 和 Stat3 (图6F)，主要参与 ERK1 和 ERK2 级联反应、细胞因子介导的信号、细胞趋化、急性炎性反应、ROS 代谢过程、趋化因子产生和细胞活化等过程 (图6G)。这些结果表明：AJSAF 通过第二信使−MAPK 通路调控体内外细胞死亡和炎性反应。

图6. AJSAF 体内外共有核心基因的功能及 Hub 基因。

6. AJSAF 通过 Ca²⁺–MAPK–CREB 通路诱导 C2C12 细胞炎性反应

AJSAF 时间依赖性显著提高 C2C12 细胞 cAMP 水平。同时，时间和浓度依赖性诱导 C2C12 细胞 Ca²⁺ 流和 ROS 产生 (图7A−C)。Western blotting 分析结果显示：AJSAF 显著促进 JNK、ERK1/2、p38 MAPK 和 CREB 的磷酸化，但对 NF-κB p65 磷酸化无明显影响 (图7D−E)。特异性抑制剂试验证实：BAPTA-AM、KG-501、SP600125、PD98059 和 SB203580 显著拮抗 AJSAF 诱导 C2C12 细胞 IL-6、CXCL1 和 COX2 等炎性因子基因和蛋白表达上调 (图7F−H)。这些结果证实：Ca²⁺–MAPK–CREB 通路介导 AJSAF 诱导 C2C12 细胞的炎性反应。

图7. AJSAF 通过 Ca²⁺–MAPK–CREB 通路诱导 C2C12 细胞炎症反应。

图8. AJSAF 诱导 C2C12 细胞先天性免疫反应的分子机制。

研究结论

AJSAF 通过 Ca²⁺–MAPK–CREB 通路引发对 C2C12 细胞瞬时的细胞毒性和短暂的炎性反应 (图8)。AJSAF 肌注接种后，对局部组织肌细胞呈现短暂的细胞毒性，释放炎性细胞因子、趋化因子和 DAMPs 等，诱导炎性反应，从而发挥佐剂活性。本研究拓展了对皂苷佐剂分子作用机制的认识，为皂苷佐剂机制研究提供了新的思路。

原文出自 Vaccines 期刊

Du, J.; Meng, X.; Ni, T.; Xiong, B.; Han, Z.; Zhu, Y.; Tu, J.; Sun, H. Mechanism of Innate Immune Response Induced by Albizia julibrissin Saponin Active Fraction Using C2C12 Myoblasts. Vaccines 2023, 11, 1576.

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  Vaccines 期刊介绍

主编：Ralph A. Tripp, University of Georgia, USA

期刊内容涵盖疫苗和免疫学相关领域的最新科研成果。美国病毒协会合作期刊，目前已被 Scopus、SCIE (Web of Science)、PubMed 等多个学术数据库收录。

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