The Innovation | 高效蛋白工程改造技术，开发新型CRISPR基因编辑工具

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读

CRISPR-Cas基因编辑技术极大程度地推动了生命科学的发展。然而，自然界大多数已发现的Cas核酸酶在哺乳动物细胞中的编辑效率很低，大大限制其在生物医学等重要领域的应用。中科院动物所李伟研究员团队设计了一种蛋白质工程化改造方法(MIDAS)，大幅提升了多种来自不同家族的Cas核酸酶在哺乳动物细胞中的编辑效率，并基于该方法开发了具有高编辑效率和广泛靶向范围的Cas12i^Max，以及具有高特异性的Cas12i^HiFi，为生命科学领域提供了强有力的新型基因编辑工具。

图1 图文摘要

CRISPR-Cas核酸酶的DNA编辑通常包括两个过程：DNA的识别和水解(图2)。前者确保了Cas核酸酶与PAM (protospacer adjacent motif)双链体结合并形成蛋白质-RNA-DNA三维复合物，后者则允许Cas核酸酶切割包裹在催化口袋中的DNA底物(图2)。Cas核酸酶完成催化必须经历这两个过程。然而，相对于微生物细胞，哺乳动物的细胞环境更复杂，使得Cas核酸酶更难切割DNA。因此，本文建立了一种蛋白质改造的方法—MIDAS(图2)，增强Cas核酸酶和PAM以及和催化口袋中ssDNA底物之间的相互作用，有望同时促进DNA的识别和水解这两个过程，从而提高Cas核酸酶的催化活性。

图2 MIDAS蛋白质改造方法的原理

MIDAS通过协同效应显著增强了Cas核酸酶在哺乳动物细胞中的基因编辑活性(图3)。团队利用MIDAS方法，成功提高了来自不同CRISPR家族的Cas核酸酶-Cas12i、Cas12b以及CasX的基因编辑效率，分别最高提升至原野生型核酸酶的137倍、11倍和465倍(图3)。

图3 使用MIDAS方法改造Cas12i、Cas12b以及CasX

MIDAS改造的Cas12i突变体(N164Y/E176R/K238R/T447R/E563R/E323R/D362R)被命名为Cas12i^Max。进一步研究发现， Cas12i^Max在人的细胞中展现了极高的基因编辑活性，对比目前广泛使用的CRISPR基因编辑工具(AsCas12a、BhCas12b v4、SpCas9、SaCas9以及SaCas9-KKH)，Cas12i^Max具有更高的平均基因编辑效率(图4)。

图4 Cas12i^Max与其他工具的基因编辑效率比较

同时，通过体外实验和高通量测序实验发现，Cas12i^Max能够高效地识别与编辑NTTN PAM以及NTNN、NNTN、NAAN、NCAN等多种non-NTTN PAM(图5，6，7)。以上结果表明Cas12i^Max具有非常广泛的基因组靶向范围。

图5 Cas12i^Max体外高效切割多种含有non-NTTN PAM的DNA

图6  Cas12i^Max在人细胞中高效编辑多种non-NTTN PAM

图7 高通量测序鉴定Cas12i^Max能够识别的PAM

最后，团队在Cas12i^Max的基础上进一步引入一个氨基酸点突变(K394A)，并将这个新的突变体命名为Cas12i^HiFi。Cas12i^HiFi在全基因组范围内表现出了极高的特异性，且能保留Cas12i^Max 90%的On-target基因编辑活性(图8)。

图8 Cas12i^HiFi展现高效率以及高保真性

总结与展望

本文报道了一种提高Cas核酸酶在哺乳动物细胞中基因编辑效率的蛋白质工程化改造方法——MIDAS。MIDAS具有很强的普适性，适用于多种CRISPR-Cas系统；并使用MIDAS开发了高效率的Cas12i^Max以及高保真的Cas12i^HiFi，为生命科学领域提供了强有力的基因编辑工具。这些改造的新型基因编辑工具在动物模型制备、作物育种、医学核酸检测、基因治疗等领域均具有广泛的应用前景。

责任编辑

武    冬   华东师范大学

张一波   中国科学院长春应用化学研究所

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原文链接：https://www.cell.com/the-innovation/fulltext/S2666-6758(22)00060-1

本文内容来自Cell Press合作期刊The Innovation第三卷第四期以Article发表的“Synergistic engineering of CRISPR-Cas nucleases enables robust mammalian genome editing” (投稿: 2022-01-12；接收: 2022-05-23；在线刊出: 2022-05-25)。

DOI: https://doi.org/10.1016/j.xinn.2022.100264

引用格式：Chen Y., Hu Y., Wang X., et al. (2022). Synergistic engineering of CRISPR-Cas nucleases enables robust mammalian genome editing. The Innovation. 3(4),100264.

作者简介

李 伟，研究员，博士生导师，中国科学院动物研究所干细胞与生殖生物学国家重点实验室副主任，北京干细胞与再生医学研究院副院长。主要从事基因工程和干细胞等创新生物技术的研发，并利用这些新技术和模型揭示哺乳动物生殖与再生的基础调控规律，开发重大疾病的基因治疗。发表学术论文100余篇。

陈阳灿，中国科学院动物研究所博士研究生。主要从事基因工程技术与基因编辑工具的开发与优化。发表学术论文4篇，申请发明专利多项。

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