【一起读文献】Neuro-Oncology：神药二甲双胍对脑放射治疗小鼠模型大脑发育的影响

导读：

       颅脑放射治疗(CRT)是治疗儿童恶性脑肿瘤和高危白血病的主要手段。尽管CRT可以提高存活率，但其已被证实会干扰正常的大脑发育，并导致癌症幸存者的认知障碍。动物研究表明，使用二甲双胍有促进损伤后大脑恢复的潜力。《Neuro-Oncology》期刊近期发表了题为“Metformin effects on brain development following cranial irradiation in a mouse model”的研究论文，作者团队研究发现二甲双胍治疗有可能改善CRT后的神经解剖学结果。然而二甲双胍的给药时机和受试者性别都会影响解剖学结果，且二甲双胍也可能对组织产生损害。作者的研究强调了在确定CRT后二甲双胍治疗的潜在益处时需要考虑的重要因素，并强调在临床研究中需要谨慎使用二甲双胍。

        二甲双胍有多种可能对大脑有益的作用。已证明它能促进神经发生和血管生成，并已被报道在卒中的啮齿动物模型中减少炎症，减轻脑萎缩，促进功能恢复。在接近辐射的时候给药可能起到辐射保护剂的作用，因此已被探索用于限制心、肺和皮肤的毒性。

       本研究中，作者的目的是通过建立幼年CRT小鼠模型来评估二甲双胍对脑结构的影响。核磁共振成像(MRI)测量使高通量活体测量能够覆盖整个大脑，其与行为相关，并具有跨物种的相关性。这些结构分析通过描述治疗效果在发育过程中的纵向进程和评估对整个大脑的影响，补充了以前的研究。作者探讨了两种不同的二甲双胍治疗方案。在这两种情况下，小鼠每天皮下注射100 mg/kg二甲双胍，连续14天。这一剂量是基于之前的报告，并具有良好的耐受性。第一组小鼠(MET16，从P16天开始用二甲双胍治疗)，即从照射当天(CRT后立即)开始服用二甲双胍，持续2周。基于作者在MET16小鼠身上的初步发现，并受到二甲双胍效应依赖于给药时机的报道的影响， 准备了第二组小鼠(MET19)，即从P19开始通过相同的程序接受二甲双胍治疗。3天的延迟被认为足以使辐射的急性影响过去，其中包括神经前体细胞和少突胶质细胞的凋亡(~24小时回到基线)，促炎介质水平的升高(48-72小时回到基线)。两组小鼠的对照组(VEH)均注射磷酸盐缓冲盐水(PBS)。图1总结了两种实验模式的时间过程和研究参数。

图1 研究辐射和二甲双胍引起的神经解剖学改变的时间线

       在P16行CRT后，通过P14、P23、P42和P98的活体纵向成像评估小鼠的神经解剖学发育，结果在图2A中以图形总结。P23(图2A，左)已经观察到假手术组和照射组小鼠之间的早期脑体积差异，在159个节段结构中有107个被认为是显著的差异(FDR<10%)，占比很大。作者进一步评估了P98的增长率和容积结果的变化(分别为图2A，中间和右列)。在乳头体、室管膜下区、侧嗅束、嗅球以及扣带回和内嗅觉皮质区域，也观察到生长速度下降，导致进行性体积减少。

       图2B-I显示了胼胝体和嗅球的样图。胼胝体(图2B-E)在P23-P14体积差(图2C)中显示出早期显著的体积丢失，但在P23-P98期间没有长期的生长变化(图2D)，导致了P98持续的体积不足(图2E)。大多数结构都表现出这种模式，致使在P98照射组小鼠胼胝体体积比对照组小。7-Gy照射剂量小鼠的嗅球(图2F-I)表现出最大的体积变化，其总体积比0-Gy对照组小8%(图2I)， P23体积损失(图2G)和P23与P98之间的生长下降(图2H)都是造成这种结果的原因。依赖成年神经发生的区域，即齿状回、室管膜下区和嗅球，在P98受到显著影响。作者还观察到雌鼠对辐射的易感性增加，雌性小鼠在P23的某些结构的体积损失略大(补充图S1)，这与之前在患者中注意到的危险因素结果一致。

图2 P16照射后小鼠大脑普遍体积减少

       为探讨二甲双胍对脑发育的影响，分别于P16(MET16)或P19(MET19)皮下注射二甲双胍100 mg/kg/d，共14天。对于0Gy-MET16治疗组，二甲双胍治疗在P23没有明显的体积变化(图3A、B和E)。在发育过程中，二甲双胍治疗提高了某些脑区的生长速度，包括小脑旁核(0.08%/d，P98时+6%，图3B-D)和基底前脑(0.04%/d，P98时+3%，图3E-G)。中脑和嗅球的额外体积增加在第98天变得明显，这表明二甲双胍治疗产生了进入成年期早期的持续变化。在P19开始二甲双胍治疗时，观察到更多的限制和更小的幅度趋势。

图3 在未受辐射的小鼠中，二甲双胍促进了脑发育过程中的生长

       为了确定二甲双胍对辐射诱导的体积变化的影响，作者研究了二甲双胍对照射小鼠的脑体积时间过程，并评价了二甲双胍与放射治疗的交互作用。在P16(MET16)开始二甲双胍治疗后，159个节段性结构中有40个由放射引起的P23体积损失加剧(图4A)。受影响的区域广泛，包括皮质、突出的白质区域和与神经发生有关的区域(齿状回、室管膜下区和嗅球)。这一发现表明二甲双胍在照射时给药有潜在的有害作用。体积损失在P98的许多结构中持续存在(图4A，右栏)。

       与MET16组相比，MET19组显示了二甲双胍治疗被认为有益的几个区域。在这组中，观察到的辐射后加剧的体积损失基本上被消除了。少数区域甚至显示出改善的P23容积结果(图4B，左栏)，例如终纹(图4B和E)。在P98观察到更广泛的体积增加，受神经发生影响的区域如海马颗粒层和嗅球等体积增加。有代表性的曲线图(图4C、D和E)显示，MET19治疗部分减轻了CRT在嗅球(图4C)、颗粒层(图4D)和终纹(图4E)引起的显著脑体积损失。这些发现表明，如果在适当的时间给予二甲双胍治疗，可以促进照射后某些脑区的结构发育。

图4  二甲双胍对受照脑组织的治疗效果取决于给药时间

      为了研究生物性别在二甲双胍和放射治疗后的体积时间过程中的作用，作者在混合效应模型中评估了性别-辐射-二甲双胍相互作用项的影响。这表明，与辐射后的二甲双胍处理的雌性小鼠相比，接受辐射的二甲双胍处理的雄性小鼠在P23处的几个区域相对较小(图5A和B)。尽管MET16的时间选择(图5A)似乎显示出更广泛的差异，但二甲双胍的两个给药时间都显示如此。另一方面，几个受影响的结构在接受二甲双胍治疗的雄性鼠中也显示出比雌性鼠更快的生长速度(图5A和B，右栏)。图5C-F提供了初级躯体感觉皮层(前肢区)和颗粒层的代表图。当按性别分开时，发现二甲双胍对辐射诱导的体积损失的早期加重主要出现在雄性7Gy-MET16小鼠中(图5D和F)，推动了平均行为的出现(图5C和E)。这种影响在7Gy-MET19组中得到了很大程度的缓解，其中P98达到了接近正常的体积(雄鼠和雌鼠都是如此)。同时，辐射后由二甲双胍即刻引起的体积损失增加在雄鼠中更为突出，而增加的性别依赖性增长率仅部分缓解了这一问题。然而，雄鼠和雌鼠都在MET19组中受益，并在放疗后显示出改善的P98容积结果。

图5 性别调节了二甲双胍在照射后大脑中的作用

       作者团队的结构数据显示二甲双胍促进了一些大脑区域的生长，包括海马的神经发生区域，因此其研究了二甲双胍对神经发生的影响。在P28，代表每个实验组的一组小鼠在P42进行免疫荧光之前接受了7天的BrdU注射。齿状回切片免疫组化染色(图6A-G)显示，MET16处理显著增加新生神经元(图6B和H)和增殖细胞总数(BrdU阳性细胞，图6B和I)，这与促进神经发生和细胞增殖是一致的。MET19治疗对未受照射的小鼠的神经发生或细胞增殖没有显著影响(图6C、H和I)，这与体积测量结果一致，表明0Gy-MET16组比0Gy-MET19组生长更广泛。

       辐射使BrdU和NeuN双标记的海马细胞(图6D和H)以及所有BrdU标记的细胞(图6D和I)显著减少。二甲双胍治疗条件对放射治疗小鼠的BrdU/Neun双阳性细胞数量均无显著影响(图6E、F和H)。与7Gy-VEH组相比，7Gy-MET16组BrdU标记的细胞总数显著减少(图6E和I)。在BrdU阳性和BrdU/Neun阳性细胞群体中，7Gy-MET19条件下的细胞计数与7Gy-VEH对照组相似(图6F、H和I)。在BrdU阳性/Neun阴性细胞计数中也观察到类似的模式。

       类似地，作者通过对胼胝体中BrdU和Olig2双标记的细胞进行量化来评估新生/增殖的少突胶质细胞和少突胶质前体细胞。作为NeuN计数的反映，MET16治疗后BrdU/Olig2阳性细胞密度增加，但MET19治疗(0Gy)后未见增加。照射显著降低BrdU阳性和BrdU/Olig2阳性细胞密度，MET16或MET19均不能使其恢复。总而言之，这些发现表明，MET19治疗后的容量恢复不仅仅是神经发生或少突胶质形成的结果-至少不是在P42从P28到P35进行BrdU标记后评估的结果。

图6  二甲双胍可促进未受辐射脑组织的神经发生和增殖

      由于二甲双胍具有促进神经发生和改善记忆的潜力，因此人们对将二甲双胍用于脑损伤修复有相当大的兴趣。鉴于大多数接受放射治疗的儿童脑癌幸存者至少在一个神经认知领域受到损害，二甲双胍治疗的好处可能会产生巨大的影响。作者在这项研究中的发现重复了之前的工作，表明辐射诱导的大脑结构的改变经历了两个阶段：第一，出现在辐射后的第一周的广泛的早期体积损失；第二，由于生长缓慢导致的较长期的组织缺陷(仅限于少数结构)。辐射后的二甲双胍治疗可以通过发育促进生长，其益处在嗅球(在MET19小鼠中为P98)尤为明显，这是一个终生需要神经前体细胞供应的区域。

      研究团队发现了照射后再接受二甲双胍治疗导致的脑体积损失比单独照射明显更多，特别是在雄性小鼠中。作者发现，放疗后在二甲双胍治疗开始前延迟3天(即MET19组)对脑组织结构结果非常有利。以前已经观察到二甲双胍治疗结果与时间的相关性；例如，在中风模型中，在大脑中动脉闭塞前3天给药会加剧中风损伤并导致代谢功能障碍，而在损伤前3周给药则具有神经保护作用。最近的研究表明，二甲双胍在CRT前治疗(从P9到P15，在P17照射前)，促进了CRT后神经再生的挽救，尽管它不能防止辐射诱导的神经干细胞枯竭。尽管这些研究中的治疗时机、治疗年龄和损害类型的细节各不相同，但很明显，给药时机需要仔细选择，确保以最小的伤害加剧风险获得益处。二甲双胍开始给药太接近受伤时间--至少在这项研究和卒中研究中是一个共同特征--可能是有害的。

       作者的另一个值得注意的发现是，尽管对未受照射的小鼠的性别效应有限，但二甲双胍对受照射小鼠的性别依赖性很强。这一结果建立在最近的一项研究的基础上，该研究表明，接受CRT治疗的幼年雌鼠(而不是雄鼠)的神经母细胞增加，认知结果改善。二甲双胍治疗在照射后1天开始，结果改善了雌性小鼠的任务表现，但对雄性小鼠没有影响。与这些结果一致的是，作者的数据表明，尽管雌性小鼠对辐射相对更敏感，但雌性小鼠与二甲双胍相关的结果更好。目前尚不清楚为什么受照射幼年雄性小鼠对二甲双胍治疗表现出更高的敏感性。在人类中，早发性神经精神障碍的易感性模式显示男性占多数。并且最近有动物研究也表明，与雌性相比，雄性小鼠相对较早地出现相对较大的性二态区域。在适当的压力源存在的情况下，敏感度/动力学上的细微性别差异可能会产生更广泛的后果。应激或免疫反应、线粒体功能、小胶质细胞数量和细胞死亡途径的性别差异可能表现在对脑损伤的不同反应中，并导致辐射后二甲双胍易损性窗口的性别差异。

      该研究发现，二甲双胍治疗可以促进照射后脑体积的部分恢复。虽然嗅球和海马颗粒层的体积有了很大的长期改善，但我们的组织学结果表明，MET19并没有实质性地改变辐射小鼠的神经发生。在研究的时间范围内，二甲双胍治疗对少突胶质细胞形成的影响似乎也相当有限，这表明其他机制可能参与了决定结果的过程。二甲双胍也被证明可以促进受损大脑中的血管生成。CRT已知会增加炎症，并可能影响血管系统，因此二甲双胍可能在大脑反应的这些方面发挥有益的作用。

       二甲双胍用于治疗糖尿病已有几十年的历史，二甲双胍的新应用很有可能很容易转化为临床实践。在儿童和青少年中，神经发生、髓鞘形成和突触修剪的过程是持续进行的。虽然与成人相比，这可能会增加儿童CRT的毒性，但它也为二甲双胍等干预措施创造了机会，这些干预措施支持或促进这些内源性过程，以促进康复。二甲双胍作用于多种生物途径，提高了区域异质性效应和个体差异性效应的广泛潜力。作者的研究结果表明，二甲双胍对辐射结果的影响取决于性别和给药时间。虽然二甲双胍在适当的情况下可以改善放疗后的神经解剖学结果，但也存在恶化结果的风险，因此需要谨慎实施。

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编 译 / 张 宇

校 审 / 蔡玉洁

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