【一起读文献】Brain:一种内源性的新tau小鼠模型

     异常淀粉样原纤维化蛋白的聚集体在神经元之间传播并传播病理的“朊病毒样传播”现象作为神经退行性疾病的新机制正在引起人们的关注。异常 tau 蛋白聚集体的积累或扩散与 tau 病的临床症状之间存在很强的相关性。tau 的微管相关蛋白包含一个微管结合域，由于tau的微管相关蛋白的转录本的 mRNA 选择性剪接，该结构域由 3 个重复或 4 个重复组成基因。虽然已经报道了许多 tau 传播模型，但大多数利用 4R (Repeat)人类 tau 转基因小鼠或仅表达内源性 4R tau 的成年野生型小鼠，并且这些模型无法再现阿尔茨海默病的病理学，其中3R和 4R tau 同时积累，或者皮克病中只有 3Rtau 聚集。这些缺陷可能反映了人类和啮齿动物大脑中 tau 异构体之间的差异。为了克服这个问题，我们使用基因组编辑技术来生成表达相同比例的内源性 3R和 4R tau 的小鼠，即使在它们成年后也是如此。研究者向这些小鼠注射了源自人类 tau 蛋白病患者大脑的肌氨酰不溶性部分，例如患有阿尔茨海默病（3 和 4R tau 蛋白病）、皮质基底节变性（4Rtau 蛋白病）或皮克氏病（3R tau 蛋白病）的小鼠）。在小鼠脑内注射后 8-9 个月，组织病理学和生化分析显示 tau 的异常积累是种子依赖性的，在注射阿尔茨海默病的大脑中具有 3 和 4R tau，仅在皮质基底节变性中存在 4R tau -注射的大脑和 3-R tau 仅在匹克氏病注射的大脑中，所有这些都包含与注射种子中发现的异构体相关的异构体。注射的异常 tau 被接种，并在注射部位和神经连接处积聚，主要在同一部位内。发现新积累的异常 tau 在这些小鼠中是内源性的，并且已经跨越了物种屏障。特别重要的是，在注射匹克氏病的小鼠中观察到匹克氏体样内含物，并再现了匹克氏病的特征积累，这表明我们已经开发了第一个概括匹克氏病病理学的模型。这些模型不仅有助于阐明涉及 3 和 4R亚型的 tau 病理学的传播机制，而且还可以重现 tau 病的病理学，这应该会导致新治疗剂的发现。并且重现了匹克氏病的积累特征，这表明我们已经开发了第一个概括匹克氏病的病理模型。这些模型不仅有助于阐明涉及 3 和 4R亚型的 tau 病理学的传播机制，而且还可以重现 tau病的病理学，这应该会导致新治疗剂的发现。并且重现了匹克氏病的积累特征，这表明我们已经开发了第一个概括匹克氏病的病理模型。这些模型不仅有助于阐明涉及 3 和 4R亚型的 tau 病理学的传播机制，而且还可以重现 tau 病的病理学。

tau蛋白在成人大脑中表达六种亚型。它们的长度从352到441个氨基酸不等，由MAPT基因转录本的选择性mRNA剪接产生。这六种异构体在天然状态下展开，不同之处在于在氨基端半部分不存在（0N）或存在29（1N）到58（2N）个氨基酸的插入。包含由外显子10编码的31个氨基酸重复序列导致产生三个tau亚型，每个亚型有四个重复（4R），其排除导致微管结合域中另外三个亚型，每个亚型有三个重复（3R）。来自tau纤维核心的重复序列的异构体组成可能因疾病而异。因此，在阿尔茨海默病、慢性创伤性脑病和神经原纤维缠结型老年痴呆症中，3R和4R tau都构成了神经原纤维缠结。然而，在皮克病中，3R tau在神经元内含物中占优势。4R tau组装成细丝是嗜银颗粒病、皮质基底变性、球状胶质细胞变性tau病理和进行性核上麻痹的特征。

2009年首次报道了异常的tau在体内繁殖。将2只P301S tau转基因（Tg）小鼠的脑匀浆注射到人2N4R tau转基因Alz17小鼠的海马和上皮质区。六个月后，观察到磷酸化tau蛋白或Gallyas-Braak阳性tau的积累。接下来，同一组将脑匀浆注射到阿尔茨海默病、神经原纤维缠结型老年性痴呆、嗜银颗粒病、进行性核上性麻痹、皮质基底变性和皮克氏病等tauopathy病的Alz17小鼠体内。除了皮克氏病外，接种了这些tau病的小鼠能够复制相应的人类病理学。接种匹克氏病脑提取物的小鼠大脑显示出营养不良的神经突起的形成，但没有匹克氏体的证据。人类4R-tau在Alz17小鼠中表达，这些脑中内源性的tau表达也是4R-tau。这可能就是为什么皮克氏病小鼠的大脑提取物（其中只有3R-tau积累）不能复制人类病理学的原因。利用重组tau在体外产生预成形纤维（PFFs），并将其注射到年轻PS19小鼠的海马中。在一个月内，发现PFF在接种部位附近强烈积聚，结果表明它们导致异常tau的积聚，并从接种部位传播到具有神经连接的大脑区域。另一组也报道了PS19小鼠海马注射P301L-K18纤维的实验，接种1.5个月后开始观察异常tau的累积。还观察到从海马到神经连接区域的后续繁殖。也有报道称，将培养细胞中制备的tau聚集体作为种子注射给PS19小鼠。在另一项研究中，年幼的PS19小鼠的单侧海马被注射了阿尔茨海默病患者的退行性变皮质基底的脑提取物。

将5-5.5月龄P301S小鼠的脑提取物用于注射2月龄P301S小鼠的海马和上皮质。在接种后2周，在海马CA1区的神经元中观察到tau累积，2.5个月后，观察到tau病理已从海马扩散到具有神经连接的大脑区域和对侧海马。目前的研究还表明tau病理学是顺行和逆行传播的。Peeraer等人构建了一个模型，在该模型中，研究者将体外产生的P301L-K18原纤维注射到P301L tau-Tg小鼠的海马中。在这个模型中，研究者能够在注射后1个月在接种侧的海马、大脑皮层、杏仁核和丘脑中诱导AT8阳性tau病理。内源性tau被敲除的Tg小鼠的tau繁殖模型中，仅表达人类六种异构体tau。给3个月大的小鼠海马注射从阿尔茨海默病患者大脑皮层分离的高磷酸化tau寡聚体，注射后11个月，观察到神经纤维改变和神经丝样病理。在小鼠模型中，人类tau仅在内嗅皮质表达，实验也表明，异常tau通过突触回路传播到海马和齿状回。2016年，报告了野生型（WT）小鼠中的tau繁殖模型，但在该模型中，成人大脑中表达的大多数tau是4R tau。从阿尔茨海默病患者的大脑中提取的沙可辛不溶性组分，用于注射WT小鼠的海马齿状回。在这些实验中，在接种后3个月，海马和海马伞中形成了类似4R tau病理的嗜银颗粒病。

一组用以下三种类型的原纤维注射WT小鼠的单侧海马：用肝素（Hep-T40）或不含肝素（X-T40）体外产生的2N4R原纤维，以及从阿尔茨海默病大脑（阿尔茨海默病-tau）提取的原纤维。接种后3个月AT8免疫组化染色显示，注射tau蛋白的阿尔茨海默病小鼠中tau蛋白病理最为广泛。从阿尔茨海默病、皮质基底变性和进行性核上性麻痹患者的大脑中提取的沙可辛不溶性组分被用于注射WT小鼠的海马和大脑上皮质。注射后3个月，AT8免疫组化染色显示在接种部位和与海马直接神经连接的区域有磷酸化tau蛋白的积聚。

     因此，2016年之前的所有繁殖模型均使用tau-Tg的过度表达，此外，小鼠表达内源性小鼠4R-tau，这是一种独特的环境。众所周知，tau亚型在小鼠大脑中的表达模式与人类不同。在人类，胎儿大脑中tau表达的亚型是3R。随后，tau的表达模式随着生长而改变，成人大脑同时表达3R和4R tau。在啮齿类动物（包括小鼠）中，在胎儿和幼年阶段，只有3R-tau在大脑中表达，但已经证明，在小鼠2周龄时，它大部分被4R-tau取代。因此，由于WT小鼠模型中仅表达4R tau，4R tau病变的病理学，如皮质基底细胞变性和进行性核上麻痹，在一定程度上可以重现。另一方面，阿尔茨海默病是一种3R+ 4R tau病，与WT脑中的皮质基底细胞变性和进行性核上麻痹相比，其播种效率较低，这可能是因为在小鼠脑中仅表达4R tau。除了一项研究外，3R tau病理模型从未被报道过。在目前的研究中，复制更多类似人类的3R +4R病理学，如发生在阿尔茨海默病中，为了建立匹克氏病传播的模型，作者利用基因组编辑技术生成了一种新的小鼠系，其内源性表达6-异构体小鼠tau，类似于人类的6-异构体小鼠tau。再利用这只小鼠开发出一种新的tau重复异构体依赖性发病模型。

作者使用CRISPR-Cas9系统在Mapt基因的外显子10和内含子10边界之间进行基因组编辑（图1A）开发了一种新的小鼠，其表现出与人类相似的tau表达模式（图1C）。再微量注射sgRNA和Cas9 mRNA后获得了26窝幼仔，分析显示18窝（69.2%）发生了基因组编辑。然后通过PCR区分的株系#2和#13，用于遗传分析（图1B）。DNA测序显示，非同源末端连接（NHEJ）发生在CRISPR-Cas9切割基因组后，除WT Mapt基因外，第2行缺失108 bp，第13行插入211 bp/4 bp缺失（补充图1）。这将消除内含子10的5'剪接位点，并阻止外显子10进行选择性mRNA剪接。编辑后的基因组产生外显子9/11 mRNA，翻译后产生3R tau（图1A和补充图1）。另一方面，编辑未受影响侧的基因组产生产生4R tau的外显子9至外显子11 mRNAs，其在WT小鼠中表达（图1A）。#2和#13系小鼠产生的两种mRNAs可能导致3R和4R tau蛋白的内源性表达（图1C）。该小鼠出生后（出生后第0天：P0）仅表达3R tau，但在P14开始表达4R tau（补充图2）。第14天之后，3R和4R tau继续表达。

从成年Tau 3R/4R和WT小鼠脑中提取蛋白质，然后用碱性磷酸酶去磷酸化，并用总Tau抗体进行免疫印迹检测tau表达模式。在WT小鼠中，仅检测到三种4R tau亚型，而在#2和#13中，除了三种4R tau亚型外，还检测到三种3R tau亚型。因此，这些新的Tau 3R/4R小鼠共表达了六种内源性Tau亚型，正如在人脑中所见（图1C）。在使用3R tau特异性抗体（RD3）和4R tau特异性抗体（RD4）的实验中，在WT中仅检测到4R tau，而在#2和#13中均检测到3R和4R tau（补充图3）。接下来，比较各亚型的表达率。当#13小鼠中的总tau设置为100%时，每个亚型的表达率如下：0N3R占比24.25±1.04% , 0N4R占比24.54±0.76% , 1N3R占比10.70±0.40% , 1N4R占比10.58±0.86%,  2N3R占比15.45±0.86% ， 2N4R 占比14.47±0.93%（图1D）。0N3R和0N4R、1N3R和1N4R以及2N3R和2N4R之间没有统计学显著差异（图1D）且发现#13中3R-tau与4R-tau的比率为1:1。

图1 tau3R/4R小鼠的产生及特征

为了建立一种新的tau病理传播模型，将含有来自患有阿尔茨海默病（AD）、皮质基底细胞变性（CBD）或匹克氏病（PiD）的tau病理患者的异常tau的沙科辛不溶性组分（5μl/小鼠）注射到tau 3R/4R小鼠的右纹状体中（前-后短径=0.2毫米，内侧-外侧=2.0毫米，背腹侧=2.6毫米），因为纹状体与其他脑区有着丰富的神经联系。脑内注射AD和CBD后3个月、6个月和9个月，或脑内注射PiD后8个月和12个月，取下大脑并用4%脑内注射AD和CBD后3个月、6个月和9个月，或脑内注射PiD后8个月和12个月，取下大脑并用4%多聚甲醛固定。切片用抗磷酸化tau抗体（AT8）染色。在注射AD、CBD或PID的小鼠纹状体（图2A、3A和4A）的注射部位观察到磷酸化tau的累积。

图2 将AD患者的沙可辛不溶部分注射到Tau 3R/4R小鼠的单侧纹状体后进行AT8阳性染色

在注射AD或CBD的小鼠中，我们观察到在注射后3个月，AT-8阳性tau主要积聚在同侧纹状体和胼胝体的神经突中。6个月时，它定位于细胞体，9个月时，At-8染色更密集（图2A和3A）。除纹状体和胼胝体外，AT-8阳性染色在9个月时分布更广泛，包括杏仁核、终纹、黑质、丘脑和几个皮质区域（图2B和3B）。补充图4显示了注射AD的小鼠大脑中的时间和空间分布。我们使用3R-和4R-tau特异性抗体进行荧光染色，以检查注射AD的小鼠大脑（图2C）。合并后的照片表明几乎所有3R-tau和4R-tau都是同域的。

在人类CBD患者的大脑中，tau也在星形胶质细胞中积累，在那里它呈现一种称为星形胶质细胞斑块的特征形式。在注射CBD的tau 3R/4R小鼠中也观察到星形细胞斑块样tau结构（图3C）。这些结果表明，在该模型中，注射沙可辛不溶性CBD部分可诱导神经元和星形胶质细胞中tau的积累。在注射PiD小鼠的沙可辛不溶性部分中，在注射后4个月时，AT-8阳性tau的积聚也主要在纹状体和胼胝体的神经突起中（图4A）。12个月时，它定位于细胞体。除纹状体和胼胝体外，AT-8阳性染色在12个月时广泛分布，包括扣带回和终纹（图4B）。在注射PiD的小鼠大脑中发现pick样小体，AT8或抗小鼠tau特异性抗体染色显示下丘脑和皮质中相对较小的圆形内含物（图4C）。注射后3个月或6个月未观察到AT8阳性染色。

据报道，皮克病的Gallyas-Braak染色呈阴性，作者为确定这一发现是否可以重现。将注射AD或CBD的小鼠大脑进行Gallyas-Braak染色，结果呈阳性，但注射PiD的小鼠大脑的Gallyas-Braak染色呈阴性（图4D），这表明注射沙可辛不溶性部分诱导的tau病理学重现了tau 3R/4R小鼠脑中的人类tau病理学。也有报道称tau的丝氨酸262（S262）在PiD中未磷酸化。用12E8（pS262）抗体对注射AD-、CBD-和PiD的小鼠大脑进行免疫组化染色，结果表明，注射AD-和CBD-的小鼠大脑中S262磷酸化，而注射PiD的小鼠大脑中S262磷酸化（图4E）。与Gallyas-Braak染色的结果类似，该模型中的tau累积模式重现了PiD中的结果。这些发现表明，向Tau 3R/4R小鼠纹状体注射沙可辛不溶性组分可再现人类Tau病的病理学。

图3 将CBD患者的沙可辛不溶性部分单侧注射到Tau 3R/4R小鼠的纹状体后进行AT8阳性染色

图4 将PiD患者的沙可辛不溶性部分单侧注射到Tau 3R/4R小鼠纹状体后进行AT8阳性染色

接下来作者研究了异常的tau积累是否以种子依赖的方式发生。脑样本切片用3R-和4R-tau特异性抗体染色。注射AD（3R 4R tau病）的小鼠表现出3R和4R tau累积。注射CBD（4R tau病）的小鼠仅显示4R tau特异性抗体的阳性染色。注射PiD（3R tauopathy）的小鼠仅3R tau染色呈阳性（图5A）。这些结果表明，使用作者开发的Tau 3R/4R小鼠的新繁殖模型重现了种子依赖性的异常Tau蛋白积累。AD、CBD和PiD注射小鼠的大脑用人类tau特异性抗体（HT7）染色，未检测到异常人类tau蛋白积累，而用小鼠tau蛋白特异性抗体染色的大脑显示异常tau蛋白积累（图5B）。这些结果表明注射人的tau蛋白已降解并低于检测限，内源性小鼠tau蛋白已转化为异常形式并积累。

图5 种子依赖性tau蛋白的增殖和内源性小鼠tau蛋白的积累

脑内注射沙可辛不溶性部分8个月后，用总tau抗体对同侧大脑进行生化分析（图6A）。在注射AD的小鼠中检测到双条带，上面和下面的条带分别代表4R-tau和3R-tau。在注射CBD的小鼠中观察到代表4R tau的单一条带。还观察到约37 kDa的截短tau的累积，这是CBD的特征。在注射PiD的小鼠中观察到代表3R tau的非常微弱的条带。在亨廷顿病或年龄匹配的对照注射小鼠中未检测到tau（图6A）。两种抗磷酸化抗体（AT8和pS396）也检测到累积的tau，表明异常的tau被磷酸化（图6B和6C）。用3R-和4R-特异性tau抗体进行免疫印迹，在AD和PiD中检测到3R-特异性抗体的条带（图6D），在AD和CBD中检测到4R-特异性抗体的条带（图6E）。这些结果表明该模型诱导了tau蛋白的种子依赖性积累。

图6 Tau 3R/4R小鼠或对照小鼠的单侧大脑纹状体内注射沙可辛不溶性部分后进行生化分析

  为了确认没有注射tau蛋白，进行了以下实验。在纹状体中注射AD-沙可辛不溶性组分后7天、14天或8个月立即取出小鼠的大脑。将左侧和右侧（同侧）大脑分开，收集沙可辛不溶部分进行免疫印迹。pS396抗体的免疫印迹（图7，上图）显示注射后立即在小鼠右脑中出现AD-tau衍生带（图7）。7天后，注射的tau几乎完全降解，14天后，注射的tau降解到检测限以下。注射后8个月，异常tau主要积聚在同侧大脑。下图中小鼠特异性tau抗体的免疫印迹显示异常tau是新积累的，由内源性tau组成（图7）。

图7 在Tau 3R/4R小鼠大脑的纹状体内单侧注射AD衍生的沙可辛不溶性成分后进行生化分析

   关于接种了具有最广泛传播的tau蛋白病理学的AD小鼠，tau病理学的传播与神经连接之间的关系如图8所示。注射部位是纹状体和大脑区域，异常 tau 蛋白的积累最终在其周围扩散。证实tau蛋白病理学传播的大脑区域显示出神经连接性，这表明该病理学的传播与神经连接性有关，而不是与邻近性有关。

图8 注射AD衍生的沙可辛不溶性成分后，与AT8阳性染色的纹状体连接的区域示意图

在本研究中，作者使用CRISPR-Cas9系统对Mapt基因进行基因组编辑。最终检测了两个小鼠系（#2和#13）。#2和#13系小鼠产生的两种mRNA可能导致3R和4R tau蛋白的内源性表达（图1B）。先前一项使用tau病患者脑匀浆进行tau注射的研究诱导4R-tau的积累，而不是3R-tau的积累。此外，当给小鼠注射人类PiD脑匀浆时，它没有显示3R tau的积累。在本研究中，作者向表达内源性3R和4R tau的小鼠注射AD患者大脑的沙可辛不溶性组分，发现它们在免疫组化（图2A-C）和生化分析（图6D和E）中显示出3R和4R tau累积。向小鼠注射PiD脑中只有3R-tau积累的沙可辛不溶性部分（图4A和B，图6D和E）或CBD脑中只有4R-tau积累时，分别发现只有3R-tau和4R-tau积累（图3A和B，图6D和E），采用免疫组化和生化方法分析。这些结果表明，这种注入模型可能有助于证明依赖种子的tau聚集。

向Tau 3R/4R小鼠的纹状体注射来自AD患者的沙可辛不溶性部分，并详细研究随后的异常Tau积累（图2A）。脑内注射后3个月，观察到神经突中有轻微的tau堆积。注射后6个月时，细胞体中At-8阳性tau的积累适度增加，9个月时，染色更密集（图2A）。此外，注射AD的小鼠体内的tau积聚扩散到杏仁核、黑质、丘脑和几个皮质，注射CBD的小鼠体内的扩散情况相似。在注射PiD的小鼠中，tau病理学的传播并不比注射AD或CBD的动物更广泛。这些结果可能是由于沙可辛不溶性组分中tau含量的差异所致。这些结果表明，tau病理学的传播可能是通过神经连接而不是邻近发生的。

  在PiD注射的Tau 3R/4R小鼠大脑（图4C）中观察到类似Pick体的圆形内含物，这些内含物在皮质和下丘脑中发现，两者都与纹状体有神经联系。然而，这些内含物比人类皮克体小一些。其原因是，注射PiD不溶性部分后经过的时间短于在人类PiD中形成Pick body所需的时间。据推测，这可能是镐体生成的前兆状态。

众所周知，在Gallyas Braak银染色上无法检测到PiD，注射AD和CBD的Tau 3R/4R小鼠大脑在Gallyas-Braak银染上呈阳性，而注射PiD的C大脑呈阴性（图4D）。接下来，我们还知道在匹克氏病中tau的丝氨酸262（S262）没有磷酸化。与Gallyas-Braak染色的结果相似，注射AD和CBD的tau 3R/4R小鼠大脑中，tau的S262被磷酸化，但在注射PiD的tau 3R/4R小鼠大脑中，则没有磷酸化（图4E）。这些结果表明，人类PiD中积累的tau的特性得到保留和传播。这种PiD注射模型相对有限，但它可以生成类似于镐体的圆形内含物，并且还能够复制阴性Gallyas-Braak和阴性pS262染色，这是人类PiD的特征。因此，它代表了研究这种疾病的第一个有价值的模型。此外，在注射CBD的Tau 3R/4R小鼠大脑皮层中发现星形细胞斑块样结构（图3C）。如前所述，当CBD衍生的脑提取物注射到Alz17小鼠时，观察到星形细胞斑块的出现。通过使用Tau 3R/4R小鼠，我们可能能够构建一个能够重现特定Tau病变特征的模型。

从注射tau病的小鼠大脑中提取沙可辛不溶性组分，并进行生化分析。用总tau抗体在注射AD的大脑中检测到双条带（图6A）。上带和下带被认为是 4R tau和 3R tau，而人类 AD 脑的肌氨酰沙可辛不溶部分与总 tau 抗体的免疫印迹显示 68、64 和 60 kDa 的三重带模式。在CBD注射的Tau 3R/4R小鼠大脑中全长Tau位置和约37 kDa（Tau的C端片段）处也检测到条带（图6A）。据报道，这条37kDa的条带是CBD的一个生化特征。用总tau抗体对人CBD脑的沙可辛不溶部分进行免疫印迹，显示双带模式为68和64 kDa。注射PiD的Tau 3R/4R小鼠大脑在全长Tau的位置显示出微弱的单带（图6A），而用总Tau抗体对人类PiD大脑的沙可辛不溶性部分进行免疫印迹显示出64和60 kDa的双带模式。人类和小鼠之间tau蛋白积累的差异可能是由于tau 3R/4R小鼠中每种异构体的表达率不同（图1C和D）。使用AT8（图6B）和pS396（图6C）抗体证实累积的tau蛋白被磷酸化。亚型特异性抗体的免疫印迹显示，RD3在注射AD和PiD的tau 3R/4R小鼠大脑中检测到异常的tau蛋白（图6D），RD4在注射AD和CBD的大脑中检测到异常的tau蛋白（图6E）。这些结果表明，脑内注射沙可辛不溶性tau蛋白组分后，tau蛋白以种子依赖的方式积累。

     作者研究了注射来自AD患者的人tau蛋白后小鼠tau蛋白的累积过程。注射后立即在大脑同侧检测到注射的人AD来源的tau蛋白，但随着时间的推移而降解，并在注射后14天降至检测限以下。八个月后，证实异常tau蛋白的累积增强。在这些小鼠中tau蛋白的异常积累由内源性tau蛋白组成，作者推断注射的人类tau蛋白已经穿过物种屏障，将小鼠tau蛋白转化为异常形式后开始累积。该实验证实了异常的 tau 蛋白具有“朊病毒样”特性。由于注入纹状体的异常 tau 蛋白主要在进出纹状体的神经连接区域传播，因此它很可能在神经回路内以顺行或逆行的方式传播。未来，将有必要研究改变接种部位是否会使异常tau蛋白的传播区域发生，是否会出现行为异常及是否会诱导神经元细胞的死亡。作者认为，这种Tau 3R/4R小鼠模型可以用于筛选能够抑制tau蛋白扩散的药物。