【一起读文献】Immunity：人COVID-19大脑的深度空间分析揭示神经炎症与小胶质-T细胞的交互关联

导 读：

   SARS-CoV-2引起的COVID-19是一种具有多器官并发症的疾病。COVID-19可引起严重的神经系统症状，但潜在的病理生理机制尚不清楚。近期，《Immunity》期刊上发表了题为“Deep spatial profiling of human COVID-19 brains reveals neuroinflammation with distinct microanatomical microglia-T-cell interactions”的文章，该项研究通过对死后脑组织的深度空间分析，确定了小胶质结节和血管周围系统中不同小胶质细胞和T细胞亚群的积累，观察到轴突损伤、病毒相关的血管周围炎症和血脑屏障受损的神经炎症。这种显著的神经炎症突出表明需要更好的策略来对抗这种COVID-19 中枢神经系统的表现。

     为了了解COVID-19相关的神经病理学中的免疫反应，作者使用IMC对死于COVID-19的患者的脑切片进行了高度多重成像。比较了(1)死于非感染性、非炎症性和非神经性原因的对照组患者；(2)尽管接受ECMO治疗但仍死于呼吸衰竭的患者；(3)明确的自身免疫性神经炎性疾病MS患者(图1A)。所有患者均采用IHC检测细胞毒性T细胞标志物CD8和髓样细胞标志物离子化钙结合接头分子(Iba)1，发现CD8T细胞浸润明显，实质Iba1⁺细胞增多。这些细胞具有典型的小胶质细胞形态，表达CD68和小胶质细胞标记TMEM119，表明脑干中存在明显的小胶质细胞激活（图1B和S1A），这表明经典的神经炎症是COVID-19相关神经病理学的组织病理学标志。

    图1 COVID-19大脑的高度复合成像质谱分析揭示了神经炎症

       然而，由于传统的IHC只能分析少数标记物，于是作者设计了一种高度复用的IMC方法，以全面分析关键的大脑免疫和实质细胞群（图1B）。人工检查IMC数据表明，COVID-19患者的脑干被CD8 T细胞和CD4 T细胞以及少数B细胞大量免疫浸润（图1C和图1D）。这种适应性免疫细胞的浸润在Iba1⁺细胞以及CD163⁺血管周围巨噬细胞数量增加的情况下发生的（图1D）。

      鉴于COVID-19大脑中显著的免疫激活，但不知道脑干中这种强大的免疫激活模式是否与组织破坏和神经元损害有关。对大脑中的淀粉样前体蛋白（APP）沉积进行量化，发现COVID-19患者有更多的APP⁺沉积，表明轴突损伤增加（图1E）。Bielschowsky银染色法可见明显的轴突稀疏，进一步支持轴突病理（图S1B）。这些分析揭示了COVID-19患者大脑中的神经炎症与显著的免疫浸润、中枢神经系统内源性先天免疫系统的激活，以及伴随的神经元损伤的增加。

补充图1 免疫组织化学检测小胶质细胞标志物和Bielschowsky染色提示小胶质细胞增生、小胶质细胞结节和神经元损伤

       为了更详细地了解SARS-CoV-2感染期间CNS的细胞表型，作者提取高维单细胞水平数据，并使用PhenoGraph算法对其进行聚类，以确定整个队列的细胞组成（图2A）。根据形态和分子表达特征，确定了丰富的基质簇（c1-c6、c9、c17、c23、c31和c33群）、神经元（c16和c28）和星形细胞（c12、c22和c30）细胞群（图2B）。还通过TMEM119和P2YR12的表达验证了小胶质细胞簇的原型小胶质细胞标记（图2C）。空间蛋白表达分析与它们各自的mRNA在人类小胶质细胞/骨髓细胞群的细胞类型图谱中的更高表达相一致。接下来在脑部免疫图上可视化了免疫细胞群，并分析了它们在患者和对照组的丰度（图2D-2F）。揭示了受COVID-19影响的患者大脑中免疫细胞组成的重大变化，从质量和数量上看，主要是激活的小胶质细胞和其他骨髓细胞群（如c7、c13、c15、c25和c26），同时还有适应性免疫细胞浸润（c19、c29和c32）。总之，通过分析确定了SARS-CoV2感染期间大脑中不同的适应性和先天性免疫细胞群，这些细胞群在对照组中是不存在的。

图2 中枢神经系统的分子和细胞普查显示了对SARS-CoV-2感染的神经炎症改变

       哪些免疫集群在COVID-19患者的CNS中被不同程度地富集或耗尽？根据上述分析，高维集群的比较表明CD8 T细胞集群c19、CD4 T细胞集群c32和血管周围巨噬细胞集群c15在COVID-19患者中明显富集（图3A）。此外，COVID-19相关的神经炎症与脑干的小胶质细胞集群（c7和c24）的显著扩张有关（图3A）。血管周围巨噬细胞群c15在COVID-19患者中的积累表明，与血管相关的炎症是神经炎症的一个潜在驱动因素。如图3B所示，通过生物信息学方法分析强调CD8 T细胞群c19细胞是c15群血管周围巨噬细胞的一种密切相互作用的免疫细胞类型。与对照组患者相比，集群c19细胞的这种邻接模式在COVID-19患者中更为显著（图3C和S4）。因为内皮细胞群c8与群c15和群c19细胞显示出类似的显著邻接关系（图3B），推测大多数CD8 T细胞在血管处浸润。通过分析确实显示了浸润的CD8 T细胞与血管系统相关性（图3D）。然而，尽管CD8T细胞优先聚集在血管附近，但许多CD8T细胞位于距离血管20mm以上的地方，这表明CD8T细胞在显微解剖上有更多的浸润部位。综上所述，这些数据表明CD8T细胞浸润和血管激活之间存在明显的联系。

图3 COVID-19脑部免疫反应的空间分析表明局部和协调的适应性免疫浸润

      c19在COVID-19大脑中的富集表明了这个免疫细胞群的核心作用。为了了解它的激活程度和效应功能，作者测试了T细胞分化、转录编程、激活/衰竭和细胞毒性等信息分子的表达。观察到c19群细胞表达CD45RO的强烈富集，表明非幼稚T细胞（图3E和S4C）。c19群细胞还高度表达HLA-DR和外切酶CD38和CD39，以及免疫检查点PD-1和Tim-3，还有转录因子Eomes和TOX，这种表型与高度活化的效应细胞兼容，可能诱发T细胞衰竭的特征。尽管一些CD8 T细胞表达了衰竭标志物，但也观察到颗粒酶B的表达升高，表明一些CD8 T细胞具有细胞毒性效应T细胞功能（图3E）。通过悬浮模式质谱分析，发现了一个COVID-19大脑中CD8 T细胞表型的异质性，在延髓和嗅球中富集了具有衰竭表型的CD8 T细胞，但也发现了其他没有典型衰竭特征的细胞毒性CD8 T细胞（图3F和S4D）。总之，在SARS-CoV-2感染过程中，CD8T细胞具有明显的激活特征，涉及多个免疫检查点，这意味着该免疫细胞群是神经炎症的中心介质。

补充图4 细胞邻域分析和质谱分析揭示了特定环境下的T细胞相互作用伙伴以及不同的激活和衰竭特征

      尽管CD8 T细胞群c19有血管偏向性，但该细胞群中并非所有细胞都与血管周围空间相关（图3D）。事实上， CD8T细胞群c19与血管周围区域外的小胶质细胞簇的COVID-19特异性邻域关系，特别是与小胶质细胞簇c13的关系（图3B和3C），表明在脑实质中存在额外的解剖学免疫位置与CD8^-小胶质细胞相互作用。为了系统地分析这些解剖区域，根据胶原蛋白/CD34和Iba1的表达观察到了关于细胞与脉管系统的距离的信息（图4A-4D）。这些分析突出了小胶质细胞结节，其中聚集了密集的Iba1⁺TMEM119⁺HLA-DR⁺小胶质细胞作为CD8 T细胞群19的一个额外的主要浸润部位。使用IMCan分析，在36%的COVID-19患者的延髓中观察到小胶质细胞结节的存在（图4E）。有小胶质结节的患者比没有结节的患者有更多的APP沉积，但这种差异在队列中没有达到统计学意义（图4F）。这些数据将血管周围和小胶质细胞结节区确定为COVID-19免疫反应的关键部位。在血管周围、联合血管、实质和小胶质结节区间的集群组成分析揭示了集群组成的主要差异（图4G）。在小胶质细胞结节中发现了集群组成的大部分变化，小胶质细胞集群c11、c13、c18、c24和CD8 T细胞集群c19以及CD4 T细胞集群c32富集（图4G和4H）。在小胶质细胞群中，c13在小胶质细胞结节中占主导地位。血管周围显示出内皮细胞群c8和血管周围巨噬细胞群c15的富集，CD8 T细胞群c19、CD3^-GzmB⁺细胞群c29和CD4 T细胞群c32的一些富集（图4G和4H）。集群组成的差异随着从血管周围到血管实质区间的距离增加，但其组成明显不同于在结节中观察到的（图4G）。这些数据说明了由COVID-19相关大脑中不同解剖区域的定义细胞集群组成的差异免疫激活，并确定了每个区域中的关键适应性和先天性免疫亚群。

图4 空间分析将免疫细胞群分配到COVID-19患者大脑中不同的解剖位置

       作者接下来测试了这些解剖区域是否对CD8 T细胞的激活和分化有影响。在血管周围、血管旁或实质隔室中，c19群细胞富含表达PD-1、CD39、Tim-3和Eomes的细胞；然而，在小胶质细胞结节中发现这些可能偏向于衰竭的活化T细胞标志物的最高表达（图5A）。小胶质细胞结节中的重要激活特征在结节中的不同免疫细胞群中共有（图4C、5B、5C、S5A、和S5B）。这些结果共同表明，在小胶质细胞结节中，T细胞和小胶质细胞集群的激活程度最高，但小胶质细胞结节和其他解剖部位的特定免疫调节分子的表达也有差异。

图5 解剖区的免疫细胞激活表明小胶质细胞结节对T细胞激活和免疫检查点表达的普遍炎症效应

补充图5 免疫激活和T细胞亚群在脑血管周围、近血管、血管周围和结节区室之间不同，并且与血管完整性相关

       CD8 T细胞群c19的亚群显示了CD8 T细胞之间的进一步异质性。与实质相关的GzmB⁺CD8亚群（sc_c2）具有典型的常驻记忆T细胞的表型，由PD-1、CD103和CD69表达表示，与结节相关的T细胞亚群相比，表达的共调控分子较少。另一个激活的GzmB⁺CD8亚群（sc_c4）被确定为小胶质细胞结节和血管周围最丰富的集群，但与优势结节集群sc_c12相比，缺乏Tim-3、CD39、HLA-DR或Tox (图S5C-S5E）。通过测量纤维蛋白原外渗来调查血脑屏障（BBB）的完整性，发现COVID19患者有明显的血管渗漏，超过了在对照组观察到的外渗（图S5F）。这些数据表明，T细胞介导的血管免疫病理学损害了BBB，导致了COVID-19大脑中的神经炎症。

       小胶质细胞结节的存在是否可能导致更严重的神经炎症。高分辨率共聚焦显微镜证实HLADR在小胶质细胞上和 T 细胞上的表达升高（图5C）。PD-1也被小胶质细胞结节中的集群c19 CD8 T细胞高度表达（图5A和5D）。通过聚类c19分析，发现在有小胶质结节的患者中，实质性的PD-1、CD39和HLA-DR表达较多。而且还观察到在血管周围的c19细胞群中Eomes表达较多（图5E）。对免疫检查点配体PD-L1的分析显示，小胶质细胞在结节中表达较多，也观察到相应的免疫检查点受体PD-1在邻近细胞上的高表达，表明细胞相互作用活跃（图5D和5F-5I）。这些数据共同说明了在所有的大脑分区中存在一个普遍的、与小胶质细胞结节的存在有关的促进炎症的作用。作者指出，在受COVID-19影响的大脑中，原子免疫调节显著差异，而且小胶质细胞结节和CD8 T细胞-小胶质细胞相互作用在协调大脑免疫反应中具有具体作用。

图6 COVID-19大脑显示疾病特异性的免疫改变

        为了了解观察到的神经炎症模式是否在其他大脑部位，特别是嗅球可侵入性入口，对12名患者的脑干和嗅球的紧密位置进行了评估。相应的脑干切片显示了类似的免疫浸润模式（图S5A）。相比之下，嗅球的切片显示出实质和免疫细胞集群的明显差异（图S6A和S6B）。小胶质细胞群c7和c21在脑干中富集，而小胶质细胞群c10则在嗅球中富集（图S6B）。在队列中，通过IMC和额外的IHC分析，观察到嗅球中的小胶质结节形成比脑干中的小胶质结节更少，这覆盖了更大的脑区（图S6C）。c12群细胞主要在延髓发现，但c22群细胞在嗅球富集（图S6B）。c22群有更多的GFAP的每细胞蛋白表达，与嗅球的反应性星形胶质增生相一致，并且也显示出更多的ACE2表达（图6A、6D和6E）。尽管细胞组成有这些差异，COVID-19患者比对照组在脑干中富集的关键免疫群体，如小胶质细胞群c13、血管周围巨噬细胞群c15、CD8 T细胞群c19和CD4群c32，在嗅球中同样丰富，表明COVID-19的核心免疫模式（图S6B）。

补充图6 比较局部和远端脑干和嗅球切片的细胞图谱，可以发现核心免疫模式，但免疫和星形胶质细胞亚型也存在区域特异性差异

       COVID-19大脑中与脉管系统免疫激活的证据提出了一个问题：这是否反映了抗原特异性反应或代表了旁观者免疫激活。为了评估COVID-19患者的嗅球和脑干中的病毒刺突蛋白，使用已建立的抗SARS-CoV₂刺突单克隆抗体，对其进行标记。抗体反应在COVID-19患者的肺部呼吸组织中呈阳性，在ECMO和MS患者的大脑中没有染色，表明具有特异性（图S7A）。IMC和IHC确定了细胞质中含有病毒蛋白的细胞，特别是血管内皮细胞为阳性（图7A和7B）。事实上，大多数SARS⁺细胞是在靠近血管的地方发现的，这与刺突阳性细胞靠近CD34、胶原蛋白和ACE2染色的情况一致（图7A-7C）。在嗅球中，观察到集群c8内皮细胞中ACE2表达的增加（图7D）。这一发现与嗅球中表达ACE2的c22群细胞的丰富程度相关（图7D、7E和S6E）。此外，COVID-19患者的c8簇细胞比对照组的细胞更频繁地被胶原蛋白包围，这表明血管激活增加（图7D）。尽管不同的检测方法存在一些差异，但通过IMC检测病毒呈阳性的样本至少有三种不同检测方法的病毒检测呈阳性（图7E）。总之，病毒抗原的存在与血管接近和ACE2的表达有关，并与整个研究中观察到的CD8和CD4 T细胞以及骨髓细胞和小胶质细胞亚群的血管周围免疫激活模式相关联。

图7 COVID-19患者在中枢神经系统中显示出与血液化学相关的疾病特异性改变

       最后，通过深度空间分析在患者的脑组织中观察到的神经炎症变化是否与他们的临床数据有关（图7F）。CD8群c19计数与CRP浓度呈正相关，而c19计数与INR和PTT呈反相关，而小胶质群c13计数与全身血红蛋白浓度呈负相关（图7F和S7C-S7E）。这些发现引起了人们对CD8驱动的神经炎症和全身炎症性促凝状态之间联系的猜测（图S5），这可能驱动COVID19中BBB的瓦解。分析表明，通过深度空间剖析观察到的神经炎症变化和免疫细胞动态的几个临床相关性。

补充图7 在COVID-19患者的肺部通过IMC检测到SARS-CoV-刺突蛋白，但在对照组中没有，特定的大脑免疫集群与COVID-19的临床措施相关

       总之，这些分析突出了血管区是COVID-19大脑中免疫激活和病毒检测的一个关键部位。这为理解SARS-CoV-2感染的神经系统合并症提供了一个框架，突出了参与COVID-19特定神经炎症模式的特定细胞脑免疫集群，并能帮助识别免疫干预的目标。

       本研究中通过深度空间免疫分析观察到的广泛的神经炎症表明了COVID-19深刻的中枢神经系统表现。该项研究强调了对大脑免疫的高参数、深度解析的空间分析的意义，这种分析能够剖析大脑的免疫群体，如不同的小胶质细胞集群，以及多个大脑区间，以了解COVID-19期间的免疫和病理生理变化。识别与疾病相关的CD8 T细胞-小胶质细胞相互作用，这种相互作用发生在特定的解剖区和涉及多个免疫检查点的确定的细胞群之间，突出了治疗干预的可能的细胞和分子目标。

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编 译 / 陈燕婷

审 校 / 蔡玉洁