改善基于mRNA的CAR-T生产工艺，“在体CAR”是否是康庄大道？

CAR-T疗法一向以“血液肿瘤特效药”、“天价药”的标签闻名遐迩。这种疗法成本巨大，制备时间长，急需技术层面的优化升级，实现“降本增效”以普及更多患者。体外CAR-T的生产制备，除了原代T细胞的活化与扩增，其核心还在于实现CAR在T细胞上的表达，这一步通常需要利用到载体将编码CAR的基因导入T细胞。然而，现有的一些体外功能性CAR-T细胞生产方案都不具备时间和成本效益。

因此，有越来越多的CAR-T企业，诸如诺华Novartis，开始采用mRNA技术生产CAR-T，临床表现出了更高的生物水平安全性与时间成本效益。在此基础上，“CAR-T 之父”Carl June与mRNA 技术奠基性人物 Drew Weissman等行业领军人物开创了mRNA转染在体CAR，在体内制备功能性CAR-T细胞治疗心脏损伤的技术应用^[1]，初步显示该技术在多维度上的优势与前景。

传统CAR-T疗法，首先需要从患者的血液中提取T细胞，并进行特定的基因修饰编程，增强其靶向和杀死癌细胞的能力。再将修饰后的T细胞在体外大量培养，最后输回患者体内。可以说，CAR-T细胞疗法自被提出以来，就一跃成为了治疗癌症的明星疗法。网传“120万抗癌神药”其实就是一种“CAR-T细胞”静脉注射液。然而，传统CAR-T疗法体外制备流程复杂，耗时较长，成药后仍有细胞因子释放综合征及神经系统毒性等不良反应产生。同时高昂的研发制备成本让许多患者望而却步，且对实体瘤作用依旧匮乏，普及能力较差。

以法国公司Cellectis、Allogene和亘喜为代表的Biotech公司，致力于开发“现货型”CAR-T产品，旨在降低生产成本，缩短治疗窗口，能更好的惠及广大患者。其仰赖的同种异体CAR-T技术也被称为“UCAR-T”，被业内认为是开创了“CAR2.0”时代的标志技术。

与传统制备流程不同的是，UCAR-T是从健康供体体内分离T淋巴细胞，通过病毒载体将CAR基因和其他基因（如自杀基因和共刺激受体等）转导入T细胞中，并利用基因编辑技术敲除会引起移植物抗宿主反应（GvHD）和免疫系统排斥的相关基因（TCRHLA等），然后使用细胞因子等刺激扩增T细胞，并基于磁珠技术分离出特定的T细胞亚群。

图：传统CAR-T制备流程

在实现体外制备技术“降本增效”的路上不断地有研究者砥砺前行。其实早在CAR-T疗法初露锋芒的时期，以诺华、Cartesian Therapeutics为首的一些公司就开始使用mRNA技术体外制备工程化CAR-T，并得到了更好的安全性数据与时间、生产成本上的显著效益。

传统CAR-T的转染，通常使用质粒作为CAR基因载体进入T细胞细胞核，然后转录成mRNA。mRNA继而被释放到T细胞细胞质中并表达CAR和相关有效蛋白质。因此，质粒的传递比直接的mRNA传递要慢，并带来了时间效益的挑战。

更重要的是，CD19导向的CAR-T细胞靶向癌变B细胞和正常B细胞，所有CD19阳性细胞的消除可能导致B细胞发育不全。这是由于，质粒传递的CAR-T细胞将显示出永久的CAR表达并在每个细胞分裂周期后依旧保持CAR表达。由于外源遗传物质的插入和免疫原性，将新基因组整合到宿主细胞核中将引发一系列安全问题。

与质粒相比，mRNA允许CAR的短暂表达，不需要基因组整合，并有可能引起更少的不良反应。不仅如此，大多数合成mRNA分子可以快速设计并以具备成本效益的方式大量生产，可大大缩短制备周期。

此外，传递到T细胞的mRNA数量可以影响T细胞中CAR的表达水平，表明基于mRNA的CAR表达可能提供了一种调节CAR-T细胞治疗相关副作用的调控机制。利用mRNA生产CAR-T细胞已逐渐成为已批准CAR-T产品生产的的替代方案。

近日，来自弗劳恩霍夫细胞治疗和免疫学研究所IZI的研究团队在Scientific Reports上发表了题为“How to improve mRNA-based CAR-T cell generation and functionality? A lab-scale comparison（如何改善基于mRNA的CAR-T细胞生成和功能？实验室规模的比较）”^[2]的文章。该文章通过对常规生产参数的调整，提出了两种优化方案，为mRNA制备CAR-T的工艺流程升级提供参考。

文章指出，高质量mRNA CAR-T细胞产品必须满足三条基本标准：

（1）保证转染前T细胞的高数量与高活力，大量高活的T细胞对于CAR-T的质量尤为重要。目前的制造工艺使用患者来源的T细胞，这些T细胞大多经过大量预处理，T细胞质量差，无法短时间内获得大量高活性的样本。

（2）mRNA应在T细胞活化后第6天至第10天之间递送。在患者白细胞去除术后，mRNA转染前增加6-10天的预扩增处理相比于没有该步骤的，显示出更有利于成品CAR-T细胞的活性和功能性的表征数据，而超过10天的T细胞活性开始下降。该结果表明，T细胞培养中，使T细胞经预扩增后更成熟稳定，对产品的质量也至关重要。

（3）CAR-T细胞功能化过程对于高效杀伤靶细胞同样重要。通过更高的CD8：CD4比率，可以促进更快速有效的细胞毒性。对于病毒转导的CAR-T细胞，CD4 CAR-T细胞最初表现出比CD8更慢的肿瘤杀伤速度，但也因此更不易耗尽，在体内起效更持久。然而，这些因素在短效CAR-T细胞中不构成问题。mRNA-CAR-T细胞的瞬时性质需要快速有效的肿瘤杀伤，因此需要高水平的CD8阳性细胞。由于mRNA的半衰期短和短效CAR表达，不需要考虑CAR-T细胞的长期持久性，也可以避免过表达引起的细胞因子释放综合征。

本文中的mRNA转染依赖于电穿孔，但该团队经比较实验后认为，基于LNP的转染方式可能是更好的实验室规模可放大的制备工艺。据悉，相关的比较研究文章正在发表准备中。

图：Fraunhofer IZI的生产流程

来自加州大学的Abraham Lee研究团队在预印本bioRxiv上发表了题为“Titering of Chimeric Antigen Receptors on CAR T Cells enabled by a Microfluidic-based Dosage-Controlled Intracellular mRNA Delivery Platform（通过基于微流体的细胞内mRNA递送平台实现CAR-T细胞上嵌合抗原受体的滴度剂量控制）”^[3]的文章。文中展示了该团队的新型声动电切割环绕穿孔平台（Acoustic Electric Shear Orbiting Poration，AESOP)，并与传统电穿孔方式进行了mRNA转染CAR-T的效益比较。

文章指出，传统的引入CAR基因的非病毒方法是进行批量电穿孔，原理是在细胞膜上打开和扩大纳米级的孔。然而，批量电穿孔最开始需要应用一个强电场诱导膜孔的初步形成，而强电场往往将直接损害细胞的生存能力。而AESOP平台使用的是机械剪切初步开孔，并用微电场扩大孔隙。该平台的声微流控将进一步将细胞与mRNA混合，确保均匀有效的摄取传递。除此之外，该团队还进一步提高了细胞处理密度和速度，将每芯片每分钟100万细胞增加到每芯片每分钟300万细胞。

图：AESOP平台处理单元

业内除了在体外CAR-T领域继续挖掘，还将目光望向了除T细胞外的其他免疫细胞，并开发出了例如CAR-NK、CAR-M等的疗法，目标是传统CAR-T无法应对的实体瘤。同时，该两种疗法也伴随着“在体CAR”这一呼声逐渐打开了行业研发的视野。而新冠mRNA疫苗的成功也为我们打开了体内递送mRNA“在体制备CAR-T”的新思路。

2022年1月，“CAR-T 之父”Carl June与mRNA 技术奠基性人物 Drew Weissman共同发表了一项具有里程碑意义的研究，为我们开拓了“在体原位CAR-T”的应用新领域。宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的研究团队利用能够编码CAR的mRNA-LNP递送小鼠体内，成功在体内实现CAR-T细胞的生成并成功修复了小鼠的心脏功能，这意味着在体CAR也将不仅限于肿瘤免疫治疗。在此番研究成果的基础上，细胞疗法公司Capstan Therapeutics脱颖而出，其科学创始人除了Carl June与Drew Weissman外，还包括宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院首席科学家 Jonathan Epstein以及Haig Aghajanian。2022年9月15日，Capstan Therapeutics宣布完成 A 轮融资并正式走出隐匿模式，目前已获得来自辉瑞、拜耳、诺华、礼来和BMS五大制药公司总计超1.65亿美元的融资。

作为mRNA领域的领头企业，Moderna也同样开始在CAR细胞治疗领域发力。2022年1月13日，Moderna就与Carisma宣布建立合作关系，将Carisama的工程巨噬细胞技术与Moderna的mRNA和LNP技术相结合，以开发体内嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR-M）疗法。

国内的远泰生物也在开发mRNA-LNP体内CAR-T/NK，并且在2022 AACR上发布了mRNA-LNP在CAR-T领域的研究进展。除此之外，凯玛生物已布局3条在体CAR-M的管线，通过体内编辑，在体原位生成CAR-M治疗实体瘤。优卡迪生物正在研发利用LNP载体递送IL-6 shRNA和CD19-CAR组合质粒，依靠IL-6敲低达到减少IL-6引起的细胞因子风暴的目的。

4月12日，上海市卫生健康委发布上海最新癌症监测数据。最新监测数据显示，上海全市新发癌症病例9.14万例，发病率为623/10万，发病前三位的癌症依次是肺癌、大肠癌和甲状腺癌；全市有3.83万人因癌症而死亡，死亡率为261/10万，癌症仍是上海市居民的第二位死因。

癌症治疗一直是医疗医药行业不断努力攻坚的领域。CAR-T疗法作为近些年最受关注的细胞疗法之一，在癌症治疗上被持续寄予厚望。然而，目前应用于临床的CAR-T疗法存在多种局限性，普及程度依然很低。尽管以CAR-T为基础的CAR-NK、CAR-M和在体CAR-T百花齐放，但短期内似乎仍有生产、效用上的诸多问题亟待解决。“降本增效”可以说是医药研究的“终极目标”，沉寂多年的mRNA技术异军突起，也为CAR-T疗法的未来发展打开了新的局面。

从2016年以来，我国监管对细胞疗法的政策发布与改变也显示，行业发展已搭上了高速铁路。相信不久的将来，人类将攻克癌症，实现将癌症变为有药可治“慢性病”的愿景。