张珍/史俊炜团队建立可用于原代细胞的简易、快速的基因编辑系统
点评 | 王东睿（浙江大学）、王皓毅（中国科学院动物研究所）
针对原代细胞的CRISPR基因编辑器的递送，是基因治疗和细胞工程中的核心问题。传统的针对原代细胞的基因编辑器递送的手段包括病毒转染策略和电击穿孔策略。其中，病毒转染策略会对细胞产生潜在的不可预知的基因组整合风险，同时该策略具有较长的实验流程；而电击穿孔策略则会对细胞造成较大的损伤，同时造成一定程度上的转录扰动。因此，建立针对原代细胞的，简单、高效且耐受性好的CRISPR基因组编辑器的递送系统，依旧是领域内的一个主要挑战。
2022年4月24日，来自宾夕法尼亚大学的史俊炜，Shelley Berger和E.John Wherry团队（一作为张珍博士）于Nature Biotechnology在线发表题目为Efficient engineering of human and mouse primary cells using peptide-assisted genome editing 的研究文章。在该文中，研究者们建立了一套多肽协助的基因编辑系统 (Peptide-Assisted Genome Editing, PAGE)，可在最小毒性下快速而强有力地编辑原代细胞。PAGE系统只需与细胞穿透性的Cas9或Cas12a和细胞穿透性内体逃逸肽共同孵育30分钟，就能实现强有力的单个和多重基因组编辑。与电穿孔法不同，PAGE基因编辑对细胞毒性较低且不显示任何显著的转录扰动。我们展示了在原代细胞（包括人和小鼠T细胞以及人造血祖细胞）中快速高效的编辑，最高编辑效率高达98%以上。因此，PAGE为下一代原代细胞基因组工程提供了一个广泛可推广的平台。
研究人员首先建立了细胞穿透性Cas9 (Cell-penetrating Cas9) 的基础分子生物学构造。经过多轮次的预筛选，确定了TAT-NLS-Cas9-NLS-GFP（Cas9-T6N）的分子框架。在此基础上，研究人员发现调节溶液中辅助分子，可以高效提升Cas9-T6N的透膜编辑效率。其中，采用和Cas9-T6N同样具有TAT 结构域的TAT-HA2多肽，可在30分钟内共孵育的情况下，将针对于报告基因的编辑效率提高到80%以上而不产生可见的脱靶效应。该系统在多个人类髓系和淋巴系的细胞中得到了初步的验证。
进一步的，研究人员将Cas9-T6N导入被sgRNA病毒载体转染后的小鼠原代T细胞中，并进行了敲除后的体外培养和体内攻毒（采用LCMV模型）实验。体外培养的体系中，研究人员实现了92%以上的敲除效率。进一步的，在体内的LCMV-Cl13攻毒模型验证实验中，研究人员不但实现了高效的PD-1敲除，并且实现了PD-1敲除T细胞在体内的长期稳定扩增，与预先的多个研究结果吻合，证明了PAGE系统的高效性和稳定性。
对于临床应用而言，最重要的CRISPR复合体形式是核糖核酸蛋白复合体 (ribonucleoproteins, RNP) 结构。然而，Cas9-T6N蛋白在RNP形态下表现出的敲除效率并不理想，因此，研究人员进行了进一步的优化和改造。采用优化后的Cas12a蛋白体系，研究人员成功的将在RNP转染条件下在小鼠原代T细胞中的基因敲除效率大幅提高。
进一步的，研究人员在人CD19-CART上面探索PAGE系统的效率。在与电击转染的头对头对比当中，PAGE系统表现出了更好的细胞活性，转染后存活细胞数量更多。更重要的是，PAGE系统处理过的人CD19-CART细胞比电击转染后的细胞，具有更稳定的转录组和更小的转录扰动，在保持高的敲除效率同时，细胞同质性更强。
图一. PAGE系统转染人CD19-CART细胞后的细胞活性和转录特征
进一步的，研究人员在CD19-CART上面尝试用PAGE系统进行多基因敲除，在最高程度上实现了近90%的三基因敲除效率，为后续在CART上面的系统性应用铺平了道路。此外，研究人员也在人造血干祖细胞上使用PAGE系统进行了基因敲除验证。在成功敲除BCL11a的增强子，或者编辑NF1A/NF1X后，HSPC在红系分化后呈现了较好的HbF表达效应，也证实了PAGE系统可供应用于遗传疾病的治疗（如镰刀型细胞贫血症等）。
综上所述，PAGE能够以快速，高效而较低成本的方式，将基因组编辑器递送入核。PAGE作为一个可拓展的平台，其下一步的重点，是针对多种原代细胞类型，以及多种基因组编辑器，设计出相应的高效递送和编辑系统，从而最终实现全方位、简易化的原代细胞编辑，助力临床研究和各种疗法的发展。
附：宾夕法尼亚大学医学院Junwei Shi实验室招博士后一名
实验室主页（https://www.med.upenn.edu/shi-lab/）。博士后所从事的方向将是：1）利用实验室最新发展的CRISPR介导的基因沉默技术，设计sgRNA文库，应用于全基因组高通量筛选 (in vivo genome wide screening) ；2）发展新的in vivo precision genome editing的技术以及在肿瘤细胞， T 细胞， 血红细胞的应用; 3) 体外进化CRISPR 蛋白 （protein evolution and Cas engineering) ; 4) 在原代肿瘤单细胞CRISPR screening (perturb-seq in primary patient tumor samples)。实验室经费充足，实验室人员之间关系融洽，合作的实验室众多。申请者应具有或将要授予博士学位(或同等学位)，英文流利，拥有分子和细胞生物学、生物化学或生信背景者优先。感兴趣者请准备CV和三位推荐人的联系方式进行投递，应聘理由为“Application for Shi lab Postdoc”。请表明自己感兴趣的研究方向、你如何适合本实验室，以及你未来的职业规划。非常感谢！
张珍于2017年起在宾夕法尼亚大学从事博士后研究，导师Junwei Shi (史俊炜)、Shelley L. Berger；博士毕业于堪萨斯大学医学中心生化系，导师Chad Slawson，主要研究蛋白O-GlcNAc糖基化对基因转录的调控；硕士毕业于第四军医大学生化系，导师张英起；本科毕业于山西医科大学法医学系。张珍在博士后期间主要从事针对原代细胞的新型基因编辑系统的开发以及耗竭性T细胞的表观遗传学调控。张珍博士有意在2024年回国发展，用人单位（高校、研究所、医药公司等）可以通过邮件和他取得联系，邮箱：zhenzhen3008@163.com。
免疫细胞与干细胞治疗已在多种疾病中实现可喜的临床疗效。目前，研究者们致力于通过更精确的基因改造，实现细胞治疗功能性与安全性新的突破。基于CRISPR的基因编辑系统是改造治疗性细胞的有力武器，带有CRISPR基因编辑的免疫细胞已应用于多项临床研究。然而，原代细胞中的CRISPR多基因编辑所需操作较为复杂，效率仍有提高空间，且耗时较长从而降低了临床可及性。同时，CRISPR基因编辑所涉及的病毒载体具有造成插入突变的风险，电穿孔操作则可能降低细胞的存活与扩增能力。如何快速高效地对造血与免疫系统原代细胞进行基因编辑，是开发新一代细胞治疗的关键技术瓶颈。
由史俊炜/Shelley Berger/John Wherry课题组合作开发的PAGE-CRISPR技术，结合了细胞穿透肽（CPP）与辅助肽（AP）两种组分，克服了既往仅基于CPP的CRISPR递送效率的局限。仅需将细胞与Cas-RNP-PAGE进行30分钟的共孵育，即在小鼠原代T细胞、人类原代T细胞和造血干细胞中实现了CRISPR基因编辑系统的高效导入，基因编辑效率达到80%以上。由于Cas同时融合有荧光蛋白，可对基因编辑后的细胞进行纯化。与电穿孔法对比，其优势在于转导后细胞活性与扩增所受影响显著减小。作者进一步将该技术与目前常用的，基于慢病毒载体的CAR-T细胞制备过程结合，在实验室体系中完成了带有单基因与多基因编辑的人源CAR-T细胞制备；在人源造血干细胞中，利用该技术敲除了胎儿血红蛋白（HbF）的重要转录抑制因子BCL11A，在其分化的原代红系前体细胞中上调HbF的表达。综上所述，PAGE-CRISPR技术实现了多种造血与免疫系统原代细胞中的高效基因编辑，提供了改造治疗性细胞的可行方案。
PAGE-CRISPR技术具有材料合成简便、操作流程快捷的特点，能够有效克服原代细胞基因编辑过程中病毒载体及电穿孔等操作造成的局限性。基于上述优势，该技术具有在其他细胞种类（如：多能干细胞；NK和巨噬细胞等免疫细胞）中实现多基因操作的前景。PAGE另一种值得关注的应用场景则是治疗性蛋白或生物大分子的递送。同时，该研究也引发一系列思考，主要包括：（1）PAGE-CRISPR的递送对T细胞体外扩增能力未见显著影响，但是否改变T细胞其他关键功能？（2）除基因敲除外，PAGE-CRISPR是否也能高效介导碱基编辑以及大片段的敲入？（3）PAGE-CRISPR系统可能造成的免疫原性将会成为其推广应用的障碍，该问题需要在相应模型中（免疫健全鼠或人源化小鼠模型）进行全面测试。总之，PAGE-CRIRPR技术作为一种优化的新型基因编辑手段，有望在多基因编辑免疫细胞、CAR分子定点整合等新型免疫细胞开发场景中实现广泛应用。
基因编辑技术虽然在过去几十年中取得了巨大的进步，特别是CRISPR-Cas系统的工具化，使得对于不同物种不同细胞类型的精确基因改造成为了可能。但是基因编辑工具只是蛋白质或者蛋白与核酸的复合物，它们需要能够进入细胞，并进一步进入细胞核，从而结合到染色质上的特定位置发挥功能。因此，开发将基因编辑工具高效递送到细胞核中的技术是基因编辑技术应用中的关键。很多重要的细胞类型，如T细胞、NK细胞、造血干细胞等，可以从人体分离并在实验室进行体外的培养与操作，目前针对这些体外培养细胞的基因编辑工具递送以电穿孔转染（electroporation）为主，给予细胞持续几微秒到几毫秒特定的电场作用，使得细胞膜上暂时形成小孔，从而导入基因编辑工具大分子。但是这一过程通常会对于细胞造成一定程度的伤害，影响其后续存活、扩增和功能。
Junwei Shi等研究组最新发表的论文 Efficient engineering of human and mouse primary cells using peptide-assisted genome editing ，为原代细胞的基因编辑提供了非常有力的递送工具。他们在Cas9蛋白上面融合了细胞穿膜肽，帮助其直接进入细胞，同时筛选了一系列可以提高Cas9进入细胞效率的小分子和多肽，发现TAT-HA2这个融合肽可以极大的提高Cas9和Cas12a进入细胞核的效率，从而实现高效的基因编辑，他们把这个系统命名为PAGE。这一系统在小鼠和人的原代T细胞以及人的原代造血干祖细胞中都实现了非常高效的多基因组位点编辑。该研究还对于PAGE处理和电穿孔转染对于T细胞的影响进行了对比，无论是从处理后细胞增值还是转录组变化方面，PAGE都体现出明显的优势。本文中PAGE主要被应用于小鼠和人的原代T细胞以及造血干组细胞，这一技术未来在其他类型原代细胞里面的应用值得期待，比如人多能性干细胞（naive or primed）、人原代NK细胞、巨噬细胞等。另外，PAGE方法只需要将适当浓度的Cas蛋白以及TAT-HA2多肽与细胞共孵育，在编辑临床应用需要的大量原代细胞应用中可能具有一定优势。最后，本文中PAGE只进行了体外基因编辑的应用，是否可以通过进一步改造或者结合不同递送系统实现体内特定组织或细胞类型的体内基因编辑，是未来令人期待的研究方向。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41587-023-01756-1
来源：BioArt
E.N.D
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