神奇的泊松分布：低浓度样品的采样概率

         低浓度样本的检测取决于2个因素：检测体系的最低检测限和采样概率（采没采到和采到了几个）。最低检测限的评估方法已经很明确了，大家参考诊断试剂评价系列4-最低检测限，你做对了吗？但是采样概率的问题大部分人都避开了，因为低浓度样品的采样涉及泊松分布的概率问题，对于大部分检测人员来说最不能接受的就是概率。我也是在某个春日的午后在咖啡和试验不顺的刺激下突然看懂了泊松分布的公式。我以我肤浅的理解给大家讲讲如何运用泊松分布公式计算低浓度样品的采样概率，文后会附上计算好的表格。

一、采样（sampling）的概率

 1. 10/sampling

    还是以汤圆举例，如果我煮一锅的汤圆，一共有500ml水，我的勺子容量是50ml，每勺可以装n个汤圆（不限数量的汤圆都可以装在一个勺里），汤圆在锅里呈自由运动。如果每一次盛汤圆都是一个独立的事件。当我往锅里放100个汤圆时，则预期每勺平均10个汤圆（浓度为10个/50ml）。但在实际每次盛汤圆的数量可能是10个、9个、11个，那会不会是1个、2个或者19个、20个？会不会一个都盛不到呢？每一次能盛到几个汤圆是未知的，但是如果我们盛无数次后，就会获得每次盛到几个汤圆的概率，这种概率符合泊松分布的规律（见下图），横坐标为每次的采样数量，纵坐标为发生概率。

     2. 3个/sampling

     当我往锅里放30个汤圆，预期每勺平均3个汤圆（浓度为3个/50ml）时（见下图），我们每次盛到2个和3个汤圆的概率最大，但是也仅22.4%，还有4.98%概率是盛不到的。这里的4.98%有十分重要的意义，后面细讲。

    3. 1个/sampling

    当我往锅里放10个汤圆，预期每勺平均1个汤圆（浓度为1个/50ml）时（见下图），我们每次盛到0个和1个汤圆的概率最大，达到36.79%。对于这个浓度，手气比检测试剂的LOD还重要了！

     4. 0.5个/sampling

    当我往锅里放5个汤圆，预期每勺平均0.5个汤圆（浓度为0.5个/50ml）时（见下图），由于我们每次只能盛到整数个汤圆（杠精勿扰），所以低于1的采样概率只是理论值，实际取样的时候一定是整数，这时取到0个汤圆的概率为60.65%。对于这个浓度，建议采样前先去雍和宫拜拜看看灵不灵！

    5. 小结

    当每次取样的预期平均汤圆数量大于3时，可以保证95%的概率能取到汤圆；当每次取样的预期平均汤圆数量为1时，每次取到0个汤圆的的概率为36.79%；当每次取样的预期平均汤圆数量低于0.7时，每次取到0个汤圆的概率大于50%。

二、取样浓度的极限

    1.3与95%

    这里有一个很重要的概率， 当每次取样的预期平均模板数量大于等于3时，可以保证95%以上的概率能取到模板。再复习一下最低检测限的概念，95%概率下能检出的最低浓度。因此可以认为3个/sampling的数量是数学上的LOD取样极限。

       2.换算关系

       3个/sampling是每次取样的预期平均模板数量，不能等同于3 copies/μL的模板浓度，而是更接近于3 copies/reaction。并且只要存在取样的环节包括采样、提取和加模板，取样的概率适用于检测的每个环节。对于采样环节，我们要保证取样量3 copies/sampling才能有效；提取的环节，我们要保证提取上样量大于3 copies/sampling；对于扩增环节，我们要保证所加模板量大于3 copies/reaction。因此扩增试剂的LOD的数学极限为 3 copies /reaction。

        3.对Ct值的影响

        荧光定量的Ct值不能表示与核酸拷贝数的直接数量关系，而是理论上的2倍相对数量关系。详细说明见做qPCR，不要钻进“唯Ct值”的牛角尖！。因此在低拷贝数下Ct值更容易受到采样概率的影响，比如2拷贝模板受采样的影响取到1-4个模板的概率为81.2%，Ct值就会有±1的变化；而拷贝数在10左右时，Ct值受采样概率的影响较小，因为采到7-13个模板的概率为73.4%，Ct值上变化小于±0.5。

    通过数字PCR来验证荧光定量PCR的Ct值，10^2 copies/μL的模板的Ct值约为30，浓度每低10倍，Ct值增加3.3, 10 copies/μL模板的Ct值约为33-34，1 copies/μL的模板的Ct值约为36-40。由于扩增效率无法达到100%，加之体系配置时可能存在取5μL只取到1个模板的小概率事件，Ct有可能会高于40个循环，但是Ct值的高低和试剂盒的最低检测限无必然的联系，试剂盒的最低检测限要求的95%概率下能检测到，偶尔一次检测结果的Ct值高或者低不会改变试剂盒的最低检测限，通过增加循环数达到提高试剂盒最低检测限更是无稽之谈。Ct值为45对应的理论模板浓度约为0.1copies/μL，这个浓度下采样为0个模板的概率是90.5%。至于Ct值为50，采样为0个模板的概率是99.0%。

    4.提高概率

    不影响实验的情况下，加大采样量或者对样品进行浓缩，可以提高采样的概率。

三、泊松分布的概率计算

    本着授人以鱼不如授人以渔的理念，还是需要介绍一下泊松分布的概率计算公式，毕竟还是有好学的同学会问到底是怎么算出来的。泊松分布适合于描述单位时间内随机事件发生的次数。

泊松分布的计算公式是：

P：发生的概率

λ：采样的预期平均值，在本应用中预期平均值λ=μ，也可用μ表示

k：模板数量，必须为整数

    不会做的同学，原博士已经为你计算好了预期平均值0.1-1和1-20模板数量的采样概率，打赏之后可查看，不想打赏也可以私信管我要。

    现实对检测的需求已经到达理论的极限，这时我们一方面要求高灵敏的检测试剂，另一方面我们也要尊重科学规律，知道哪些可为哪些不可为。文中如有不准确的地方，请大牛们批评指正！

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