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上周与大家分享了Nature Biotchnology的好文 《DNA提取也能发Nature?》

本以为只是偶发的宏基因组方法评估类的高分文章，谁知道拔起萝卜连着泥，其竟然还有一篇姐妹篇，依旧是发表在Nature Biotechnology，依旧是方法评估！

综合看下来，其设计更复杂，涉及的实验环节更多，与生物信息更息息相关，更加值得我们关注。

Sinha R, Abuali G, Vogtmann E, et al. Assessment of variation in microbial community amplicon sequencing by the Microbiome Quality Control (MBQC) project consortium.[J]. Nature Biotechnology, 2017.

研究目标：评估16S扩增子宏基因组测序过程中不同阶段（DNA提取、样本保存、测序和数据分析）对结果的影响

样本数：23个。（注：虽然比上篇的2个样本数略多了一点，但比起现在动辄上百上千的样本数研究还是少很多，可见实验贵在精，即使少样本数依旧可以发高分文章）

23份样本，包括11份新鲜的粪便样本，7份冻干的粪便样本，2份Chemostat培养后样本，2份模拟样本，和1份阴性对照样本。

方法：所有样本经分装至96孔板后被分送至15家实验室分别进行DNA提取、16S建库和高通量测序。所得测序结果被分送至9家实验室分别进行生物信息分析。

关键字：15家实验室+9家数据分析 又是一个多单位大动作的联合实验对照

实验所涉及的对照：

（1）样本类型：粪便 vs 口腔；新鲜样本 vs 冻干样本；真实样本 vs 模拟样本

（2）DNA提取：中心实验室集中提取 vs 15家实验室分别提取；各实验室采用不同的DNA提取protocal（Mobio vs Promega vs Qiagen等）

（3）建库方法：16S扩增引物 （V3-V4 vs only V4）

（4）测序方法：Hiseq vs Miseq；单端测序 vs 双端测序；测序长度150bp~300bp

（5） 生物信息方法：QIIME vs UPARSE vs 很多。。。。

下表为文中涉及的各方法。左列为方法类别和方法名，右列为采用该方法的实验室数量。

注：本文涉及的对照方法太多，最终测序的样本数高达15,749个，其中真实样本1,991个，模拟样本(Artifical 样本)2033个，以及1725个chemostat samples。每个样本的测序read数在3万5至4万左右。

这篇牛文的内容过于丰富，结果太多，仅附图就有15个，附表9个，附文9个。在本文中，小编仅取部分精华与大家分享，更多细节请参照原文~

一句话结论： 不同实验阶段（样本提取、建库、数据分析）对最终结果皆有一定影响，其中DNA提取影响最大。

该文的结果与其姐妹篇一致，皆证实了DNA提取方法对结果的显著影响，如下图所示，使用不同DNA提取方法，样本中各菌属的丰度会发生明显变化。

下图中横坐标代表不同的DNA提取方法，

本文还罗列了近年的相关文章，进一步证实该结果的可靠性。如下表所示，+表示该因素对结果有显著影响。

在该实验中，作者设计了两个阶段的双盲检测，阶段1（实验）+阶段2（生物信息分析），文中评估不同因素对结果的影响，结果显示DNA提取方法影响实验结果，且其影响程度高于生物信息学方法。

如下图所示，不同颜色代表不同类型的样本（Human\Chemostat\Artifical\Blank），纵坐标越高代表影响较大。由图可知，不同提取方法的影响高于不同数据分析方法的影响。不同方法对真实样本的影响高于对模拟样本的影响。

相比较于真实样本，模拟样本受不同方法的影响较少。

如图所示，左图为真实样本，右图为模拟样本。横坐标为不同实验室。图中可见真实样本不同实验室的处理结果有明显差别。

以HL-A实验室为例，其所处理的所有样本中Lactobacillus与其他实验室相比都有升高。另有三家实验室有明显的Pseudomonas升高。

实验采用Tris-HCL buffer做为阴性对照样本，在不同实验室中检测出不同的污染菌。

微微碎碎念：作为一只生物信息狗，小编为啥一直一直关注测序实验的文章呢？

这篇文章帮我做出了最好的回答~

测序实验作为数据的来源，其中有太多的影响因素（坑）存在了。实验过程（Protocal）的所导致的对结果的变化远大于生物信息方法。

因此，在我们这些生物信息狗选择程序、纠结参数、优化结果之前，实验阶段的严格把关、标准化处理，才是我们应该最先关注的！

你以为你找到了Marker菌，也许只是实验污染。

你以为两组样本间有显著差异，也许只是采用了不同的protocal。

为避免这样的惨剧发生，小编再次呼吁

测序实验标准化很重要！

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