单链pMHC文库用于高通量抗原特异性T细胞发现与分析
将肽、MHC重链和β2m亚基串联构建为单链三聚体（SCT），然后通过生物素和链霉亲和素与荧光标记偶联聚合成四聚体，构建pMHC高通量文库，有助于抗原特异性CD8+T细胞新的克隆型发现。SCT文库是鉴定识别常见病毒表位的T细胞的有效工具，有研究者利用SCT文库从新冠肺炎患者和健康献血者中捕获SARS-CoV-2特异性CD8+T细胞，并克隆成TCR-T细胞以验证其功能，该技术能快速分析基于肽的T细胞反应，包括自身免疫、癌症或传染病等。新冠疫情更是推动了表位筛选的发展，这种技术也可有效评估新兴疫苗（如个性化癌症疫苗）和过继细胞疗法。这些疗法通常由基于HLA的表位预测算法指导，如NetMHCpan/MHCflurry等，这类算法会产生多个假定抗原。可溶性pMHC通常通过在大肠杆菌中表达HLA重链和β2-微球蛋白（β2m）亚基，收集包涵体并与靶肽体外重折叠产生，这种方法的产量受HLA和肽限制，且保质期都是有限的。SCT提供了一种替代的pMHC结构，可以解决这些问题。
在这里首先证明了18种HLA-A*02:01肿瘤相关抗原（TAA）的检测案例，利用9种不同连接子L1与HLA来评估肽和L1/HLA对SCT蛋白表达和稳定性的影响。接下来通过常见病毒表位的SCT证明其在疾病背景下的功能，然后利用SCT平台对数百个病毒表位进行评估，最终发现了两个SARS-CoV-2蛋白结构域的免疫原性表位，并分离了其对应的TCR，最后克隆并对其功能研究证明其具备CTL杀伤能力，验证了该策略的实用性。
结果
SCT文库制备方案如图1a所示，首先将肽序列转化为DNA引物通过PCR的方式构建生产SCT载体，然后转染到Expi293细胞中以诱导SCT蛋白产物的分泌，最后进行BirA酶生物素化、His-Tag纯化和四聚体化。
为了探索肽抗原对SCT产量的影响，使用D3模板（图2b）制备了已知HLA-A*02:01表位的18个SCT的文库，并将SCT区域放在IRES-GFP序列之后，这样无论肽或SCT表达水平如何，转染后细胞都将表达GFP（图1b,c）。流式检测GFP阳性细胞表明，转染效率（~70%）在所有SCT构建体中是一致的（图1b），而IRES-GFP的插入，证明SCT的表达量受具体肽表位的影响（图1c）。
SCT在哺乳动物细胞中表达，可能导致折叠pMHC中不会出现翻译后修饰，研究者通过NXT糖基化共有序列的表位来探索这种影响，通过分析去糖基化后的SCT发现SCT可以进行蛋白质加工，可能包含相关的翻译后修饰（图1d）。
接下来探讨了各种连接肽L1与HLA定点突变对SCT表达量和SCT捕获特抗原特异性T细胞的影响，最终模板使用D9，连接子为GGGGS，并引入HLA分子中的Y84C和A139C两个突变，研究蛋白表达情况。将该模板质粒文库转染到Expi293细胞中，并基于SDS-PAGE分析SCT蛋白的表达发现与肽和模板的蛋白质产量的变化有关（图2b）。
利用差示扫描荧光法测量与蛋白质疏水区结合的荧光染料（SYPRO）的强度分析了SCT文库的热稳定性，热稳定性较差的蛋白质表现出较低的熔融温度。将高表达水平的的SCT纯化到pH 7.4的PBS缓冲液中，测量的Tm值在文献预期的范围内[Structural engineering of pMHC reagents for T cell vaccines and diagnostics]，并揭示了同一肽从野生到突变再到二硫键连接的稳定性增加趋势（图2c）。对于三种肽（YMLDLQPET、YMLDLQPETTDL和RMFPNAPYL），折叠的pMHC显示出比SCT对应物更高的相对Tm，在所有肽中，H74L变体的SCT热稳定性高于野生型。
研究人员选择构建WT1特异性C4αβ-TCR，验证WT1肽（RMFNAPYL）的SCT四聚体的结合特异性功能，通过与MART1特异性F5-TCR以95/5的比例混合转导Jurkat，然后用WT1-SCT四聚体检测，对于WT1表位SCT四聚体，D3、D5和D9模板选择性捕获了81–94.0%的WT1特异性细胞群（图2d）。这些结果表明，最佳的四聚体性能并不一定与最高的热稳定性相关。
接下来，研究人员基于CMVpp65表位肽（NLVPMVATV）的SCT和折叠的pMHC四聚体，分离CMV有反应的A*02:01供体中CMV特异性CD8+T细胞，并进行10×单细胞TCR测序，将得到CDR3区与公共数据库比对，结果表明检测到的CMV特异性TCR链与文献[VDJdb: a curated database of T-cell receptor sequences withknown antigen specificity]报道的具有高度相似性。两个克隆（图2e红色和浅橙色）与文献中CDR3序列完全匹配（LD = 0）。另一个克隆包含一个α/β对（图2e浅绿色），值得注意的是这两条链此前都被报道过，这些结果表明SCT四聚体至少具有与折叠pMHC类似的性能。
接下来，使用SCT四聚体鉴定和捕获抗原特异性T细胞，方案如图3a。首先使用模板D3，表达了SCT文库，该文库来自常见病毒株（CMV、EBV、流感和轮状病毒）的A*02:01和A*24:02的66个已知表位。然后针对每个HLA选择了十个最高表达的SCT，并合成了相应的肽，将这些SCT和肽应用于三种方法获取抗原特异性T细胞（图3a）。
方法1，从健康供体PBMC（A*02:01或A*24:02）中分离单核细胞，并用混合细胞因子成熟DC，将成熟DC与1 µg/mL的HLA限制性肽共孵育，随后辐照。然后将从自体PBMC纯化的CD8+T细胞与这些肽负载的DC孵育8-10天，诱导抗原特异性CD8+T淋巴细胞的选择性刺激和扩增，随后经过两次肽脉冲照射的自体PBMC刺激和扩增T细胞。通过流式检测这些扩增的T细胞对20种肽的特异性。（图3b）
方法2，将来自每个供体的所有T细胞系合并，并用别藻蓝蛋白（ACN）标记SCT四聚体的合并文库染色，对样品进行ACN阳性T细胞分选，然后进行T细胞快速扩增。为了评估该细胞群中不同抗原特异性的T细胞的频率，以其对每种肽响应产生的IFNγ进行评估（图3c）。结果证实了结合每种SCT的T细胞对天然肽具有反应性，方法1和2表明SCT可以合并在一起以捕获和促进靶向抗原特异性T细胞群的扩增。
方法3，使用相同的SCT文库从供体PBMC中直接分离未扩增的CD8+T细胞，纯化类似方法1与方法2的T细胞群体。与方法2一样合并荧光标记的SCT四聚体，以直接分选来自相同供体的未扩增的CD8 T细胞。然后使用相同的方法快速扩增T细胞，并通过IFγ进行评估其功能（图3d）。值得注意的是，在三种方法中，可以分离T细胞的表位非常相似（图3e）。方法3证明，可以使用合并SCT和简化的扩增方案来富集肽响应的T细胞克隆库，这种高效的方法还减少对内源性TCR的扩增。
使用NetMHC4.0预测与HLA-A*02:01、A*24:02或B*07:02的结合亲和力为500 nM或更强的表位肽，分别筛选得到了96、51和33个表位肽。对Nsp3蛋白（木瓜蛋白酶样蛋白酶，PLpro）对A*02:01进行相同的预测过程，产生了191个肽，所有SCT均使用D9模板生成（图2b）。
首先使用这些库研究HLA匹配的新冠肺炎患者是否共享免疫原表位。将每个文库的SCT组装成带有PE标记四聚体，然后合并用来富集每种HLA患者和一个未感染A*02:01健康供体PBMC中的抗原特异性T细胞，对其进行染色和分类（图4a），将表达CMV pp56肽的A*02:01 SCT（ACN标记）作为对照。然后扩增捕获的T细胞，并通过流式检测单个SCT四聚体的抗原特异性，在不同的人员中检测到针对相同表位特异性CD8+T细胞（图4b），表明HLA相同的患者对于SARS-CoV-2，存在免疫显性表位。
为了检测SARS-CoV-2特异性T细胞的TCR库，用DNA barcode标记的SCT对扩增群体进行染色，使SCT捕获后能够通过10×单细胞测序与特异性TCR克隆型配对（图4a）。对于7种抗原和3种HLA等位基因的7个SCT，鉴定了一个主要克隆型（图4c）和许多亚克隆型，选择了其中几个克隆型进行克隆并验证其功能。克隆步骤包括CRISPR/Cas9敲除内源性TCRα/β链，SCT四聚体用于评估新的TCRα/β的有效性以及随后扩增的TCR-T的纯度（图4d）。
用特异性TCR-T与HLA匹配的APCs以2:1的效靶比在肽负载和不负载肽的情况下共同培养（1 µM）。使用A*02:01/NY-ESO-1（157–165）和A*02:0.1/CMV pp56（495–503）抗原特异性TCR-T细胞作为阳性对照。16h共培养后，ELISA检测三种效应分子（TNF-α、IFN-γ和粒酶B）的含量。测量结果通过每个读数中的最高值单独归一化，并绘制在热图上（图5b）。
在不存在靶肽的情况下，阴性对照和与APC共培养的所有TCR均检测不到效应功能蛋白，相反，大多数SARS-CoV-2特异性T细胞（20/31），以及阳性对照NY-ESO-1+157-165和CMV pp56495-503特异性T淋巴细胞可以检测到效应分子，并在用对应的肽负载APC激活后促进细胞凋亡。所有SARS-CoV-2特异性T细胞克隆型产生的颗粒酶B水平高于阴性对照，而亚群产生的是TNF-α和IFN-γ。
SCT库技术比体外折叠pMHC相对快速和容易的方式生成pMHC。反过来，这些文库能够对抗原特异性CD8+T细胞群进行高度多重富集。由抗原配对的TCR克隆型的功能数据表明，SCT文库可用于捕获对抗原呈递细胞产生TCR依赖性细胞毒性反应的T细胞，因其高通量特性可应用于肿瘤新抗原筛选，病毒抗原鉴定等，或可为癌症免疫提供大量可靠的靶点。
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