拒绝伪定量，数字PCR如何回归真定量！

        如果说Kary Mullis发明了聚合酶链式反应法将生物学划分为前PCR时代和后PCR时代，那么数字PCR的产生将分子检测划分为了定性检测时代和定量检测时代。但是数字PCR检测≠定量检测，数字PCR只是一个工具，只有这个工具具备了定量检测的条件才能实现真正的定量检测，否则都是“伪定量”。

    加油站：PCR检测技术概述

一、什么是定量检测

   1.定性和定量检测

     通俗的理解，定性检测是测定待测物的“质”，如物理、化学、生物等，鉴定其是与非，有和无；定量检测是测定待测物的“量”，如质量、长度、物质的量等等。

    2.核酸检测方法中的定量检测方法

    是否为定量检测不是以检测结果是否是数值为依据，对于核酸检测，OD260/280计算核酸浓度和荧光定量PCR都是定性检测方法；只有数字PCR属于定量检测方法。

    3.数字PCR的伪定量

    数字PCR是一个定量工具，但是如果数字PCR方法没有经过充分验证，获得的定量结果也只是个伪定量结果，或者结果不准确，或者偏差较大。目前在数字PCR推广和使用中最大的问题就是：数字PCR厂家只强调仪器的硬件参数（分割单元数、多通道和开发的系统）；用户将荧光定量PCR方法在不做方法优化和验证的情况下直接应用于数字PCR平台，最终的结果是数字PCR成为一个定量不准的定性检测工具。

    4.计量溯源

      要实现定量，通常需将测量的结果与国际单位制SI单位联系起来。国际单位制的七个基本单位：长度（米）、质量（千克）、时间（秒）、电流（安培）、热力学温度（开尔文）、物质的量（摩尔）和发光强度（坎德拉）。

    “具有计数特征的量（包括特定核酸序列的拷贝）的单位为1。单位为1的单元本质上是任何单元系统的一个元素。单位为1的量可视为可溯源至SI 单位摩尔。因此，可以通过适当的、经过验证的测量程序来得出对SI的计量溯源性。”-ISO 20395：2019

  5.不确定度

    追求真值和追求真理一样困难！定量检测的最大困难是测准，因为真值永远是求之而不得的，也是人类孜孜不倦努力的目标。我们当下能做到的是获得真值所在的区间，并不断缩小这个区间，这个区间就是不确定度，它包含了测量中所有产生的误差（不确定分量）。

dPCR检测方法的不确定度分量鱼骨图

二、数字PCR

    数字PCR从提出概念到真正成熟的产品QX200上市用了约10年的时间，这一时期可看作是数字PCR的“启蒙时代”；从2011年到2020年约10年里进入了伯乐一家独大的“霸主时代”；从2020年前后至今，国产的新羿生物、思纳福、锐讯，国外的凯杰、赛默飞、罗氏纷纷推出新产品，数字PCR进入了百家争鸣，群雄逐鹿的“战国时代”。

1.数字PCR的原理

    数字PCR是将核酸模板分布在等体积的多个分割单元中，使得一些分割单元包含模板而其它分割单元不包含模板，然后对目标序列进行PCR扩增并检测特定的PCR产物，通过阳性率和泊松分布计算获得模板中靶序列拷贝数浓度。数字PCR的核心原理就是有限稀释、终点PCR和泊松分布！

2.数字PCR的分类

    按照单元分割的方式数字PCR分为液滴式数字PCR、芯片式数字PCR和微滴芯片式数字PCR：

 2.1液滴式数字PCR：通过油包水生成技术，生成几万个微滴，以伯乐和新羿生物为代表：

2.2芯片式数字PCR：使用物理分割的方法，将反应液分布到几万个微孔中，以赛默飞、凯杰和罗氏为代表：

2.3微滴芯片式数字PCR：分割方式仍然是生成油包水的微滴，但是将微滴形成单层平铺到芯片上，以STILLA和思纳福为代表：

3.泊松分布

    很多人对数字PCR定量结果的质疑往往来源于泊松分布导致的概率，由于以往的核酸检测都是定性的，人们已经习惯了阳性或者阴性的“确定性”结果，而不习惯于存在概率和不确定度的“不确定性”结果。但是事实的情况是越能计算出概率和不确定区间的结果越准确，只给出阴阳性的结果越不准确。

     加油站：神奇的泊松分布：低浓度样品的采样概率

三、数字PCR的方法验证

    一个完整的数字PCR方法包括了数字PCR仪、适配该仪器的试剂、引物探针的优化和最佳反应条件。在没有经过充分验证之前，“傻瓜式”快速建立的数字PCR方法很难能成为一个精确定量的方法，只是一个伪定量方法。定量检测与定性检测最主要的差异是定量方法需要对最低检测限、最低定量限和正确度进行验证。

1.精密度Precision

    精密度可分为方法的重复性（repeatability），中间精密度（intermediate precision）和再现性（reproducibility）。在实验室内部验证时，应确定方法的重复性和中间精度。可以使用单因素方差分析（ANOVA），计算重复性。

2.线性Linearity

    通过对预期核酸量值与观察到的核酸量值进行回归分析，以斜率和相关系数R来表征该范围内的线性度。

    观察值与期望值的期望斜率为1.0，截距为（0,0）。建议斜率在0.95至1.05之间。相关系数R2应大于0.99。

3.正确度Trueness 

    测量正确度是该方法产生的无限个结果（即现实中的大量结果）的平均数与接受参考值间的一致程度。优先使用有证标准物质获取合适的参考值。

4.稳健性Robustness

    在稳健性测试中，应研究相关方法参数中的小偏差对方法性能和测量结果的影响。可能影响方法结果的相关参数，如引物和探针的浓度、PCR试剂的成分、PCR仪和退火温度。

5.特异性specificity

    应评估分析对预期目标的特异性以及与典型生物样品中可能存在的同源序列的潜在交叉反应性。

6.最低检测限limit of detection，LOD

    可被检出的最低浓度。LOD在不同标准中有不同的计算方式，如：目视评价法，空白标准偏差法、标准方程法和信噪比法。对于数字PCR的LOD评估我个人比较倾向于使用空白标准偏差法评估LOD。

   空白标准偏差法：既通过分析大量的样品空白或加入最低可接受浓度的样品空白来确定LOD。独立测试的次数应不少于10次，计算检测结果的标准偏差，计算方法见下表：

7.最低定量限limit of quantitation，LOQ

    样品中的分析物可被定量检测的最低浓度。通常建议空白值加上10倍重复性标准偏差，也可以3倍的LOD或高于方法确认中使用最低加标量的50%作为LOQ。

    我从2012年就开始接触数字PCR，后来因为一直从事核酸标准物质的研究，需要不断的开发数字PCR的定量方法，目前已经使用过的数字PCR仪大概有10种。数字PCR本应定位为一个高灵敏度和准确度的定量工具，各厂家应聚焦于如何提高仪器的精密度和准确度，筛选最匹配的反应体系，开放平台扶持专业的方法开发者。但是目前的一种不良倾向是大家都在拼硬件性能（微滴数更多，荧光通道更多），过度宣传自己平台的开放性和通用性，回避普通用户自己建立定量方法的难度。硬生生把一个定量工具变成了更灵敏的定性或伪定量工具。数字PCR是时候回归真定量了！

参考文献：

1. ISO 20395:2019 Biotechnology — Requirements for evaluating the performance of quantification methods for nucleic acid target sequences — qPCR and dPCR

2. GB/T 27415-2013 分析方法检出限和定量限的评估