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基因编辑进入迷你时代

烟雨平生 细胞与基因治疗领域 2023-12-01
前言
CRISPR-Cas作为一种新兴的基因编辑系统,已在基因表达调控、致病基因筛查和遗传病治疗等领域展现了巨大的应用前景。CRISPR-Cas系统主要包含 Cas基因和CRISPR基因座,CRISPR基因座由前导序列、重复-间隔序列和回文重复序列组成。前导序列负责将重复-间隔序列和回文重复序列转录形成pre-crRNA,pre-crRNA成熟后可形成crRNA。crRNA可通过核酸互补,引导Cas蛋白到目标核苷酸序列,实现精准切割。根据CRISPR-Cas作用模块的数量和种类, CRISPR-Cas系统被分为两类。第一类CRISPR-Cas系统包括类型I、III、IV,由多蛋白效应复合物与crRNA组成,而第2类CRISPR-Cas系统包括类型II、V和VI,为单一蛋白效应器。目前常用的DNA或RNA编辑器,如Cas9, Cas12和Cas13则分属第2类系统中的类型II、V和VI, 并通过不同的作用机制切割目的片段(图1和图2)。由于常用的Cas9, Cas12a和Cas13a大小接近4kb, 而用于递送基因编辑器到体内的AAV系统的包装上限约为4.7kb,因此寻找更小的基因编辑系统对于其高效体内递送具有重要意义。本文将对近年来有关迷你基因编辑系统的研究进展做简要梳理。
1. Cas9
II 型 CRISPR 系统根据 Cas9 蛋白之间的同源性程度等可细分为type II-A(包括SpCas9和SaCas9)、type II-B和type II-C三个亚型。来源于化脓性链球菌的SpCas9,基因编辑范围广、活性高,但其核苷酸序列长度为4.1kb,包装进入AAV困难,因此用于基因治疗较为困难。尽管来自金黄色酿脓葡萄球菌中的SaCas9大小为3.1kb, 但其识别的目标DNA序列中需要一个较长的NNGRRT PAM序列,因此限制了其编辑范围。针对该问题,王永明课题组2021年4月开发出SlugCas9-HF,大小与SaCas9相当,特异性比SaCas9和SpCas9都高,识别NNGG PAM,编辑范围与SpCas9一样大[1];2021年12月该课题组又开发出SchCas9,识别更简单的NNGR(R=A or G) PAM,编辑范围在原来的基础上又翻了一倍[2]
Type II-C Cas9如NmeCas9, Nme2Cas9, CjCas9, GeoCas9, BlatCas9和 PpCas9等其大小较SpCas9小,但由于Type II-C 较type II-A Cas9活性降低或其靶基因识别也需要一段较长的PAM序列,因此研究人员依然在构建新的Type II-C Cas9系统,使其具有较高核酸酶活性和较短的PAM序列[3]。2022年8月,王永明课题组Elife文章展示其开发的 Nsp2-SmuCas9嵌合体,长度约为1000 氨基酸, 可识别N4C PAM,是目前最简单的PAM Type II-C Cas9系统[3];但其编辑活性扔有待提升。

图1 Cas9、Cas12和Cas13比较[4]
图2. 第2类CRISPR-Cas系统分类[5]
2. Cas12
与Cas9不同, Cas12系统识别的PAM在靶序列5’端,并以T和C为主, Cas12识别目标双链DNA并切割产生粘性末端。Cas9在识别gRNA中7、 8个碱基后,就开始与目标DNA结合;而Cas12在与目标DNA完全结合之前需结合18个碱基,此过程中若存在碱基无法配对,Cas12将与目标DNA脱离。因此,研究认为Cas12的特异性普遍较Cas9高。最常用的Cas12a变体自氨基酸球菌属(asCas12a)和鞭毛藻科细菌(LbCas12a),不需要tracrRNA,在基因编辑中得到较多应用。asCas12a和LbCas12a大小与SpCas9相当,因此也不便于AAV包装。基于此,李伟课题组和张锋课题组相继开发了AaCas12b和BhCas12b,大小为1100多个氨基酸,降低了活性Cas13蛋白的大小[6, 7]。2018年Doudna课题组发现Cas14(又称Cas12f1,~500 氨基酸),可介导单链DNA切割[8],随后该课题组于2019和2020年又分别开发了DpbCas12e(~1000氨基酸)和Cas12j(又称CasΦ, 700氨基酸)[9, 10]。2021年Yong-Sam Kim、季泉江和亓磊组相继开发Un1Cas12f1(537 氨基酸),AsCas12f1(422 氨基酸)和SpaCas12f1 (497氨基酸),和CasMINI (源自Un1Cas12f1,529氨基酸)[11-14]。Cas12f 核酸酶作为最紧凑的 CRISPR核酸酶,其大小仅为传统 Cas9  和Cas12a 核酸酶的一半,然而2022年胡家志课题组通过比较发现Un1Cas12f1, CasMINI和 AsCas12f1等新型Cas12f核酸酶的编辑活性普遍较Cas9或Cas12a低,而AsCas12f1在大多数编辑位点活性普遍较差[15]。因此Cas12f需要继续提高其编辑活性,以推动迷你编辑器在基因定点突变、外源DNA插入等领域中的广泛应用。除此之外,2022年11月杨辉课题组在Protein & Cell 期刊发表了其最新的Cas12编辑器-hfCas12Max(~1000氨基酸),hfCas12Max 识别5’-TN 或5’-TNN PAM 序列,并在检测的目标序列中展现出优于SpCas9和LbCas12a的切割活性,且脱靶率较低,因此具有潜在的应用前景[16]
3. Cas13
Cas13蛋白属于2类VI型 CRISPR-Cas 系统,至少包括 Cas13a(1250氨基酸)、Cas13b(1150氨基酸)、Cas13c(1120氨基酸) 和 Cas13d四种亚型[17]。与Cas12-crRNA复合物靶向双链DNA不同,Cas13 和crRNA组装形成一个由60~ 66 nt crRNA引导的RNA 靶向效应复合物。crRNA包括一个促进与相应Cas13蛋白酶结合的直接重复(Direct repeat,DR)序列以及一个特异性靶向RNA的间隔序列。Cas13a、c和d的DR序列在5’端, 而Cas13b的DR序列在3’端。与Cas9和Cas12依赖PAM识别靶序列不同,Cas13 需要靶序列侧翼存在PFS序列,但 PFS 对 Cas13 核酸酶活性不是必需的[18]
2021年张峰课题组发现Cas13b家族成员中的Cas13bt(~800氨基酸)同样可介导RNA编辑[19],同年杨辉课题组鉴定到两个新的Cas13家族成员,并命名为Cas13X(775氨基酸)和Cas13Y(790氨基酸),尽管通过改造获得的Cas13X.1切割活性较Cas13a和Cas13b低,但展现出与Cas13d类似的切割活性和特异性[20]。2022年杨辉课题组通过蛋白质工程等手段开发出Cas13X的升级版-hfCas13X,显著降低了Cas13X的旁切活性,增强了其对RNA编辑的高保真性[21]
4. IscB和TnpB
2021年张峰课题组在Science发文,通过使用进化分析、RNA 测序和生化实验,在 IS200/IS605 转座子重建了 CRISPR-Cas9 系统的进化过程,发现IscB/IsrB 可用RNA介导双链 DNA的切割,并用于人类细胞的基因组编辑。另外,该课题组还在IS200/IS605 转座子上发现了另一个蛋白TnpB,同样具有RNA 引导的核酸酶活性[22]。IscB和 TnpB 可能分别是Cas9和Cas12的祖先, 而IsrB可能是IscB的前身。IsrB 大小约为350氨基酸,IscB大小约为400氨基酸,TnpB大小约为550氨基酸,可在ωRNA的引导下切割目的DNA。ωRNA大小为200-400nt的非编码RNA, 明显较Cas9(~100nt)和Cas12 (~40nt) 的向导RNA序列长度多。由于IscB和IsrB大小仅为SpCas9的五分之二,因此它们可能与胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)、腺苷脱氨酶(TadA)或逆转录酶(RT)形成融合蛋白,以一种较小的蛋白复合物形式发挥胞嘧啶碱基编辑器(CBE)、腺苷酸编辑器(ABE)或先导编辑器(PE)的类似功能。基于IscB和IsrB的上述基因定点编辑系统,其大小有望限制在AAV包装的上限(约为4.7kb),因此具有极大的临床应用价值。
Cas9 拥有HNH 和 RuvC两个核酸酶活性结构域,而 Cas12只有一个 RuvC 核酸酶活性结构域,但两者都具有一个可结合引导RNA的α-螺旋识别结构域(REC)。IscB保留了与Cas9相同的RucV和HNH结构域,而IsrB在IscB的基础上进一步缺失HNH结构域,因此尺寸更小。IscB和IsrB都利用ωRNA对靶序列进行识别,较长的ωRNA序列通过形成复杂三维结构起到Cas9和Cas12 中REC结构域的作用[23, 24]
5. 迷你Cas临床前进展
目前基于Crispr-Cas系统的临床或临床前研究依然依赖于与SpCas9和Cas12a,由于其分子过大,一般采用双AAV载体或非病毒载体(如脂质纳米颗粒)递送体内;但上述方法将降低基因编辑器的体内递送效率。因此开发迷你基因编辑系统使其能被单AAV载体包装,对提高体内递送效率具有重要意义。2021年由杨辉教授创建的辉大公司宣布其自主研发的Cas13X和Cas13Y的底层专利正式获美国专利局授予专利权,并与2022年获得数亿元的C轮融资,以加速迷你型RNA编辑器-Cas13X和Cas13Y 相关的技术研发及临床研究。2022年由斯坦福大学亓磊教授创立的Epic Bio公司宣布获得A轮5500美金融资,用于探索其构建的迷你型DNA编辑器CasMINI在治疗人遗传病中的应用潜力。
有问题欢迎联系作者交流(1105699422@qq.com)

参考资料:

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1.Hu, Z., et al., Discovery and engineering of small SlugCas9 with broad targeting range and high specificity and activity. 2021. 49(7): p. 4008-4019.

2.Wang, S., et al., Compact SchCas9 Recognizes the Simple NNGR PAM. 2022. 9(4): p. 2104789.

3.Wei, J., et al., Closely related type II-C Cas9 orthologs recognize diverse PAMs. 2022. 11: p. e77825.

4.Puig-Serra, P., et al., CRISPR Approaches for the Diagnosis of Human Diseases. 2022. 23(3): p. 1757.

5.Wang, J., et al., The rapidly advancing Class 2 CRISPR‐Cas technologies: A customizable toolbox for molecular manipulations. 2020. 24(6): p. 3256-3270.

6.Teng, F., et al., Artificial sgRNAs engineered for genome editing with new Cas12b orthologs. 2019. 5(1): p. 1-4.

7.Strecker, J., et al., Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing. 2019. 10(1): p. 1-8.

8.Harrington, L.B., et al., Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes. 2018. 362(6416): p. 839-842.

9.Liu, J.-J., et al., CasX enzymes comprise a distinct family of RNA-guided genome editors. 2019. 566(7743): p. 218-223.

10.Pausch, P., et al., CRISPR-CasΦ from huge phages is a hypercompact genome editor. 2020. 369(6501): p. 333-337.

11.Kim, D.Y., et al., Efficient CRISPR editing with a hypercompact Cas12f1 and engineered guide RNAs delivered by adeno-associated virus. 2022. 40(1): p. 94-102.

12.Wu, Z., et al., Programmed genome editing by a miniature CRISPR-Cas12f nuclease. 2021. 17(11): p. 1132-1138.

13.Wang, Y., et al., Guide RNA engineering enables efficient CRISPR editing with a miniature Syntrophomonas palmitatica Cas12f1 nuclease. 2022. 40(13): p. 111418.

14.Xu, X., et al., Engineered miniature CRISPR-Cas system for mammalian genome regulation and editing. 2021. 81(20): p. 4333-4345. e4.

15.Xin, C., et al., Comprehensive assessment of miniature CRISPR-Cas12f nucleases for gene disruption. 2022. 13(1): p. 1-10.

16.Zhang, H., et al., An engineered xCas12i with high activity, high specificity and broad PAM range. 2022.

17.Ashraf, S., et al., RNA Editing with CRISPR/Cas13, in The CRISPR/Cas Tool Kit for Genome Editing. 2022, Springer. p. 219-254.

18.Huynh, N., et al., A versatile toolkit for CRISPR-Cas13-based RNA manipulation in Drosophila. 2020. 21(1): p. 1-29.

19.Kannan, S., et al., Compact RNA editors with small Cas13 proteins. 2022. 40(2): p. 194-197.

20.Xu, C., et al., Programmable RNA editing with compact CRISPR–Cas13 systems from uncultivated microbes. 2021. 18(5): p. 499-506.

21.Tong, H., et al., High-fidelity Cas13 variants for targeted RNA degradation with minimal collateral effects. 2022: p. 1-12.

22.Altae-Tran, H., et al., The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases. 2021. 374(6563): p. 57-65.

23.Hirano, S., et al., Structure of the OMEGA nickase IsrB in complex with ωRNA and target DNA. 2022: p. 1-7.

24.Schuler, G., C. Hu, and A.J.S. Ke, Structural basis for RNA-guided DNA cleavage by IscB-ωRNA and mechanistic comparison with Cas9. 2022: p. eabq7220.

E.N.D


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