外泌体递送mRNA的包封方法与靶向策略
mRNA在20世纪60年代早期首次被发现，它是基因和蛋白质之间的关键中介。从那时起，科学家在提高mRNA的稳定性和降低其免疫原性方面做了大量的工作。此外，mRNA传递装置的创造也引起了许多研究者的注意。依托两种新冠mRNA疫苗获批，mRNA作为一种新的药物瞬间获得了巨大的发展。如今，基于mRNA的治疗方法在预防性疫苗、蛋白质替代治疗、癌症免疫治疗和基因编辑等方面都显示出了广泛的应用。
在没有递送系统的帮助下，外源性mRNA很难在人体中发挥生理作用，这表明了载体对基于mRNA治疗的重要性。目前，多种纳米材料包括脂质基和聚合物基纳米颗粒被开发出来用于mRNA传递。其中，脂质纳米颗粒已广泛用于临床前和临床试验。尽管对递送平台的研究越来越多，但仍有几大挑战尚未解决，如剂量限制毒性和mRNA向肝外组织的特异性传递。在这种情况下，细胞来源的囊泡，如外泌体（EV），由于其良好的生物相容性、细胞特异性和跨越生理屏障功能，在mRNA传递领域受到越来越多的关注。本文综述了细胞源性囊泡介导的mRNA传递及其在生物医学中的应用。
01
外泌体包封mRNA的策略
将mRNA装入细胞来源的囊泡的策略可以简单地分为两大类，即预加载方法和后加载方法（如下图所示）。预加载方法，也称为预分离或内源性加载方法，严重依赖于生物发生过程中生产细胞将mRNA货物打包到EV中。有时，在内源性加载过程中，mRNA编码的蛋白质也会同时被包装成细胞来源的囊泡。预加载方法可以进一步分为被动类别和主动类别。后加载方法也称为分离后或外源性加载方法，此法主要通过电穿孔或化学转染试剂将外源性mRNA装载到分离的EV中。
两种将mRNA载入外泌体的策略
由于小RNA是分泌的外泌体中RNA的主要形式，将大mRNA封装成纳米外泌体对于被动预加载方法在技术上具有挑战性。结果表明，上述技术不仅提高了外泌体的产量，而且提高了外泌体中的mRNA含量。此外，与传统的电穿孔方法相比，这种策略也导致了mRNA进入外泌体的负荷更高。
（二）主动预加载方法
另一个提高mRNA装载效率的策略是用两种类型的质粒转染生产细胞。一种质粒编码由mRNA结合成分和EV富集蛋白组成的融合蛋白，如表面标志物CD9、CD63，或细胞膜蛋白Hspa8。一般来说，从质粒转录的感兴趣的mRNA包含有意设计的识别位点，它可以与融合蛋白的mRNA形成特异性结合。融合蛋白的剩余部分，即EV富集蛋白，在其生物生成过程中被纳入EVs，以实现活性mRNA的预加载。
靶向和模块化EV加载（TAMEL）是一种主动加载平台，通过将富集EV的蛋白融合到MS2噬菌体外壳蛋白上，主动将mRNA加载到外泌体中。然后将同源的茎环序列整合到mRNA载体中，促进mRNA结合并加载到EV内部。研究发现，这一方法的加载效率会随着mRNA大小的增加而降低。
（三）后加载方法
到目前为止，将mRNA载入EV后，在很大程度上依赖于电穿孔和商业加载试剂。电穿孔是一种常用的将各种分子包括siRNA和miRNA、以及mRNA装载到纯化EV中的方法。大约五分之一的Cas9 mRNA可以通过电穿孔装载到红细胞来源的EV中。此外，一种名为REG1的商业装载试剂也被用于将mRNA在其分离后装载到EV中。
02
mRNA靶向表达的策略
为了提高外泌体的组织特异性，人们提出了几种策略，如下图所示。
基于外泌体的组织特异性mRNA表达平台
03
结论与展望
外泌体有望递送各种小分子、siRNA和miRNA。近年来，这些自然发生的囊泡已被应用于mRNA的传递，它们为提高mRNA治疗从肿瘤到COVID-19等多种疾病的疗效提供了一个很有希望的机会。然而，在转化应用之前，还有一些障碍尚未得到解决。包括固有异质性囊泡的关键参数的标准化，如表面特征和自体内容物。此外，在目标器官中的生物分布也值得进一步改进。未来，合理设计工程化的EVs将为开发更有效和更有选择性的细胞源囊泡提供巨大价值，从而加速它们的临床转化。
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