用于NK细胞的mRNA-LNP制剂筛选和优化
自然杀伤（NK）细胞通过基因编码的表面受体消除癌症和病毒感染的细胞，参与免疫系统。因其先天的独立性以及显著降低毒性，已经成为过继细胞治疗（ACT）中T细胞的替代品。用mRNA工程化NK细胞增强其肿瘤靶向性和细胞毒性，在ACT中显示出巨大的潜力。然而，NK细胞的mRNA转染具有挑战，最常见的递送方法，如电穿孔，具有局限性。因此，一种能够在保持细胞活力的情况下实现高mRNA转染效率的替代性非病毒递送系统将有利于NK细胞疗法的发展。
这项研究中，分别基于聚合物文库和不同的可电离脂质，研究了用于向NK细胞递送eGFP mRNA的聚合物和脂质纳米颗粒（LNP）制剂。基于阳离子聚合物的mRNA纳米颗粒显示出NK细胞的有限内化和低转染效率。另一方面，通过调整脂质摩尔比和制备参数来优化mRNA-LNP制剂，从而在NK细胞中获得高转染效率（～100%）和高蛋白表达。总之，与聚合物和电穿孔相比，当在NK（KHYG-1）和T（Jurkat）细胞系以及脐血来源的NK细胞中测试时，优化的LNP显示出更高的转染效率和eGFP表达。因此，基于LNP的mRNA递送是进一步开发新型NK细胞疗法的一种有前景的策略。
研究亮点
β-谷甾醇LNPs显示出优良的转染效率和表达强度。
为了研究聚合物在NK细胞中的mRNA转染潜力，首先合成了阳离子聚合物pHDPA、pHDePA、pHPMA-DAE、pDMAEMA和PEG-pDMAEMA。通过聚合物的胺基和mRNA的磷酸基团之间的静电相互作用，阳离子聚合物与mRNA自组装，形成聚合物纳米颗粒。为了研究聚乙二醇化和交联的影响，首先用PEG-BCN通过无铜点击化学对pHDPA复合物的叠氮化物基团进行后修饰，然后加入DTT使聚合物的吡啶二硫基化学交联。然后用蔗糖作为冷冻保护剂将这些聚合物冷冻干燥，并在转染前溶解在无核酶水中。
mRNA聚合物的一个重要参数是N/P比，即聚合物的胺基与核酸的磷酸基团的比率。N/P比率不仅对聚合物的特性起着关键作用，而且对细胞的转染效率和活力也起着至关重要的作用。尽管在较高N/P比下制备的聚合物可以增强的细胞摄取和内体逃逸，但过量的阳离子聚合物通常对细胞活力产生负面影响。为了避免潜在的毒性，因此在以下转染实验中排除了高N/P比率，使用10的N/P比来配制pHDPA、pHDePA、pHPMA-DAE、pDMAEMA和P5D39聚合物，PEG化的pHDPA复合物的N/P比为4，对于PEI聚合物，选择40的N/P比。
如表1所示，除了pHDPA（具有和不具有PEG化和交联）形成具有负ζ电位的纳米聚合物外，其他聚合物带正电，其尺寸范围为138至199nm（表1）。仅在没有PEG化的pHDPA和P5D39的情况下分别产生56nm和77nm的较小颗粒。
▼表1 mRNA聚合物的表征
为了研究聚合物对于NK细胞的mRNA转染效率，首先使用了一种更容易转染的细胞系HEK293T细胞，Lipofectamine3000™ 作为阳性对照。各种聚合物的mRNA转染效率如图1A，对于细胞的毒性如图1B。其中pHDPA聚合物不具备转染能力，P5D39与DMAEMA有较低的转染效率，PEI聚合物约50%转染效率。各种聚合物毒性如图1B，除P5D39外，所有聚合物均将HEK293T细胞的存活率保持在95%，P5D39表现出细胞毒性，存活率降至约50%。
接下来，在NK细胞上评估聚合物介导的mRNA递送（图1C）。在两种NK细胞系，即KHYG-1和NK-92中筛选出了PEI、P5D39和pHPMA DEAE，Lipofectamine3000™ 用作对照。只有少量NK细胞呈eGFP阳性（PEI为0%，P5D39为0.5%，pHPMA-DAE为0.5%）。Lipofectamine脂质复合物对NK细胞的转染效率也最低（～0.05%）。与HEK293T细胞类似，P5D39聚合物引起细胞毒性，KHYG-1和NK-92的细胞活力分别降至66%和85%（图1D）。
聚合物转染mRNA的效率较低，表明聚合物的摄取与mRNA内体逃逸受限。为了评估NK细胞对这些纳米颗粒的摄取，配制了含有Cy5标记编码eGFP mRNA的PEI、P5D39和pHPMA DEAE聚合物，并转染KHYG-1细胞。转染后24小时通过荧光显微镜观察结果，如图1E所示，观察到Lipofectamine3000TM和P5D39聚合物的较高细胞摄取（Cy5信号），而缺乏eGFP表达，表明孵育24小时后，这些聚合物仍在细胞内还未释放。PEI和pHPMA-DAEE聚合物显示缺乏细胞摄取，这解释了NK细胞中转染活性低的原因。
2LNP介导mRNA转染NK细胞
由于聚合物eGFP mRNA纳米颗粒在NK细胞中的表达有限，因此研究了LNP转染NK细胞的潜力。用可电离脂质C24、Lipid 5和SM-102制备的LNP（图2A 1-3），N/P比为3，首先在KHYG-1细胞中，评估其转染效率和对细胞活力的影响。在微流控制备过程中，以体积比为1:1.5（乙醇相：水相），总流速TFR为4mL/min。如图2B所示，当使用高剂量时，C24-LNP转染仅有3%的eGFP阳性细胞。由Lipid 5和SM-102可电离脂质组成的LNP成功转染了KHYG-1细胞，Lipid 5转染效率为48%，SM-102转染效率在70%左右。然而，由于本实验中只使用了一个N/P比，我们进一步进行了优化步骤以确定最佳配方参数。
▲图2 使用LNPs将mRNA递送到KHYG-1细胞并筛选不同的可电离脂质
在优化过程中，对颗粒的大小、PDI和ζ-电位进行表征，并通过流式评估转染效率、eGFP表达强度（gMFI）和细胞活力，如表2所示。为了确定转染KHYG-1细胞的最佳电离脂质，筛选了Lipid 5和SM-102的不同N/P比的LNP。对于SM-102，N/P=3和5的LNP显示出相似的转染效率，根据剂量的不同，转染效率在82%到84%之间。不同的是，N/P比率对Lipid 5起着关键作用，因为与N/P=3相比，N/P=5不仅显著提高了转染效率，从36%提高到90%（低剂量），而且gMFI从3提高到2819（表2）。毒性方面，当3和5的N/P用于两种可电离脂质时，细胞活力95%。还应该提到的是，N/P比的差异不会影响颗粒的大小，因为SM-102和Lipid 5在N/P=3和5中的大小范围为105至110nm（表2）。正如预期的那样，当使用更高的N/P比时，ζ电位略有增加，SM-102和Lipid 5分别从−3.5到−2.7 mV和从−6.2到−4.9 mV。由于与SM-102相比，基于Lipid 5的LNP制剂显示出更高的表达强度，因此使用Lipid 5 N/P比为5的可电离脂质进一步优化。
▼表2 脂质纳米颗粒的优化
用β-谷甾醇和豆甾醇取代胆固醇（图2A 6-8）被报道可增强内体逃逸，从而增强蛋白质表达。而在研究中，豆甾醇取代导致PDI为0.63的高度多分散颗粒，这可能是由于聚集，导致较低的转染效率（约36%）和非常低的gMFI（表2）。另一方面，与基于胆固醇的LNP相比，掺入β-谷甾醇不仅显著提高了转染活性（低剂量为87%对56%，高剂量为84%对70%），而且还显著增加了eGFP的总表达（表2），且基于胆固醇和β-谷甾醇的制剂在粒径和ζ电位方面没有显著差异，分别产生92和86 nm的颗粒，ζ电势略负，约为−2 mV。此外，用胆固醇制备LNP时，mRNA包封率更高，观察到的eGFP的表达差异可以用LNP的形态来解释。先前使用冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）、差示扫描量热法（DSC）和膜流动性测定法研究了胆固醇和植物甾醇LNP的形态差异，表明β-谷甾醇LNP具有更高程度的片层性，与含胆固醇的LNP相比，外部脂质层中的脂质组成不同。冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）图像清楚地表明，用胆固醇和天然类似物制备的LNP显示出核壳结构，具有无定形核和片状表面。然而，与显示均匀弯曲外层的基于胆固醇的LNP相比，具有天然类似物（如β-谷甾醇）的LNP表现出多方面的表面。β-LNP的结构变化会增加颗粒的脆性，从而增加其与内涵体膜的融合，最终增强mRNA的释放。
在LNP的微流控制备过程中，优化配方参数也发挥了重要作用。当TFR以1:1.5的体积比（EtOH:水相）从11 mL/min降低到9 mL/min时，低剂量转染效率从87%下降到30%，高剂量从84%下降到15%（表2），ζ电位保持在−2 mV左右，但粒径从86 nm增加到137 nm。相反，当TFR降低到9mL/min，同时体积比从1:1.5增加到1:3时，eGFP阳性细胞的百分比分别为92%和94%（低剂量和高剂量），这是本研究中最高转染效率。1:3的体积比导致更高的gMFI水平和eGFP表达（表2）。
优化结果表明，LNP的最佳脂质为Lipid 5、DSPC、DMG-PEG2K和β-谷甾醇。此外，N/P比为5和体积比为1:3（EtOH：水相）的TFR为9mL/min是LNP微流控制备的最佳参数。除了脂质组成和配方参数的影响外，两种mRNA剂量转染NK细胞都是有效的。因此，使用较低剂量（每孔500ng mRNA）进行下一步实验。
在两种免疫细胞系：KHYG-1 NK细胞和Jurkat T细胞，使用优化后的LNP（Lipid 5、N/P=5、β-谷甾醇、TFR 9mL/min和1:3体积比）与电穿孔比较mRNA递送效率。对新制备LNPs表征后（表3），按照转染方案将KHYG-1和Jurkat细胞与该mRNA-LNP一起孵育。
▼表3 优化的mRNA-LNPs表征
如图4A和B所示，LNP和电穿孔分别导致92%和85%的eGFP阳性KHYG-1细胞，同时保留了细胞活力（99%）。重要的是，图4C和5显示用LNPs转染导致gMFI比电穿孔增加35倍。
▲图4 优化的mRNA-LNPs与电穿孔在KHYG-1和Jurkat细胞中的比较
▲图5 各类mRNA递送方式在KHYG-1细胞中24小时后的荧光显微镜图像，比例尺=300μm
在Jurkat细胞中观察到类似的情况，如图4A-C所示，LNP的转染效率优于电穿孔，而电穿孔细胞活力明显下降，当与LNP一起孵育时，Jurkat细胞活力仅下降了4%。通过FC测量的gMFI有明显差异，与电穿孔相比，LNP的eGFP表达增加了54倍，在图6的荧光图像中可看出较为明显的差异。
▲图6 各类mRNA递送方式在Jurkat细胞中24小时后的荧光显微镜图像，比例尺=300μm
这些研究表明，与电穿孔相比，LNPs表现出更好的细胞相容性或较低毒性、优越的转染效率和更高的eGFP表达，并为工程化NK细胞临床提供了一种有前途的工具。
为了了解优化的mRNA-LNP制剂潜在的应用价值，研究了其在脐血来源的NK细胞中的效率。LNP在转染效率方面优于电穿孔，与电穿孔的57%相比达到75%（图7A）。至于毒性，两种递送技术都表现出相当高的细胞活力，达到99.5%（图7B）。而eGFP表达强度有显著差异，其中与电穿孔相比，优化的LNP导致gMFI增加了5倍（图7C）。
▲图7 脐血来源的NK细胞中优化的mRNA-LNP与电穿孔的比较
此外，荧光显微镜图像显示NK细胞中eGFP的表达（图7D），清楚地展现了LNP转染具有更高水平的蛋白质表达，与电穿孔相比有更亮的荧光信号。这些发现表明，优化的LNP在体外来源的NK细胞中更有效地促进eGFP mRNA递送和随后的蛋白质表达。
以每孔500 ng mRNA-LNP为最高浓度，进行浓度梯度研究优化的mRNA-LNP制剂用于KHYG-1 NK细胞转染，以评估优化的LNP在较低mRNA浓度下的mRNA递送潜力。为此，制备eGFP mRNA-LNP，并在KHYG-1细胞系中以1.9至500ng/孔（2.5×104个细胞）的不同mRNA浓度进行测试。结果显示，在所有剂量下，eGFP mRNA转染效率一致较高，其值在89%至92%之间。此外，无论mRNA浓度如何，细胞活力都保持在约99%不变。然而，在gMFI中观察到一个显著的趋势，表明随着浓度的降低，gMFI减少，这意味着细胞荧光水平降低。具体而言，500 ng的高剂量报告了55×10^3的最高gMFI值，1.9 ng的低剂量报告了1.5×10^3的最低值。值得注意的是，每孔15.6至250 ng的mRNA浓度达到了15×10^3至30×10^3的相似gMFI。
▲图8 在KHYG-1细胞中进行eGFP mRNA-LNPs的浓度梯度研究
这些发现表明，虽然转染效率和细胞活力在整个浓度范围内保持在高水平，但mRNA浓度与细胞内蛋白质表达相关。此外，低于500ng的浓度在转染效率和gMFI方面都显示出巨大的潜力。为了防止高生产成本，未来的研究中，可以考虑每孔低于500ng mRNA的标准剂量。
目前，在正在进行的临床试验中，将mRNA递送到NK细胞的主要技术是电穿孔。然而，诸如对电穿孔细胞的形态和表型以及对mRNA完整性的影响等缺陷，现已将焦点转移到纳米颗粒作为转染剂上。在本研究中，确定一种用于NK细胞离体工程化的mRNA递送技术。这里比较了聚合物、LNP和电穿孔以获得最佳的eGFP mRNA递送。证明聚合物mRNA导致NK细胞有限的转染效率和细胞摄取。相反，LNP对脐血来源的NK、KHYG-1和Jurkat细胞显示出有希望的结果。具体地，当使用Lipid 5作为可电离脂质时。LNP优化显示，在较宽的mRNA浓度范围内，N/P=5，用β-谷甾醇取代胆固醇，TFR为9mL/min，体积比为1:3（EtOH:水相），不仅增加了eGFP阳性细胞的数量，而且增加了细胞内eGFP的蛋白表达。与电穿孔相比，观察到转染效率、蛋白质表达和细胞形态的改善。需要进一步的研究来评估用mRNA-LNPs治疗后NK细胞受体的功能，而这项研究证明了LNPs在临床开发新型NK细胞疗法方面的潜力。
参考文献：
https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2023.08.014.
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